中藥莪術(shù)中抗腫瘤成分莪術(shù)醇人工抗原的合成與鑒定

1、中藥莪術(shù)中抗腫瘤成分莪術(shù)醇人工抗原的合成與鑒定【摘要】目的合成莪術(shù)醇全抗原并加以鑒定。方法先用莪術(shù)醇與琥珀酸酐為原料，以三氯甲烷為溶劑，4-二甲基氨基吡啶(DAP)作催化劑，反響合成半抗原莪術(shù)醇琥珀酸單酯，然后，用1-乙基-33-二甲基氨基丙基碳二亞胺法將莪術(shù)醇琥珀酸單酯偶聯(lián)到牛血清白蛋白，合成了莪術(shù)醇的人工抗原，并用激光解析飛行質(zhì)譜ALDI-TF-S進展了鑒定，利用質(zhì)譜特征求得了偶聯(lián)物中莪術(shù)醇與牛血清白蛋白的量，計算出結(jié)合比。結(jié)果成功地合成了莪術(shù)醇人工抗原，其結(jié)合比為19.6。結(jié)論用1-乙基-33-二甲基氨基丙基碳二亞胺偶聯(lián)法可合成莪術(shù)醇的完全抗原?！娟P(guān)鍵詞】莪術(shù)；莪術(shù)醇；1-乙基-33-二

2、甲基氨基丙基碳二亞胺；人工抗原；莪術(shù)醇琥珀酸單酯Abstrat：bjetiveTsynthesizeandidentifytheartifiialantigenfurul.ethdsFirstly，ahaptenfurul,urul-heisuinate(ur.-HS)assynthesizedusingaterialfurultreatithsuinianhydrideinhlrfrandtrae4-diethylainpyridine(DAP)asatalyst.Thenthehaptenasnjugatedtbvineserualbuin(BSA)using1-ethyl-3-(3-di

3、ethylainprpyl)arbdiiide,(ED)ethdandtheharaterizatinftheantigenasexainedbyALDI-TF-S,andthenjugatinratifurultBSAasdeterinedithALDI-TF-S.ResultsTheartifiialantigenassuessfullysynthesizedandidentifiedbyALDI-TF-S.ThenjugatinratifurultBSAas19.6.nlusinTheartifiialantigenfurulissuessfullysynthesizedbyEDethd

4、.Keyrds：RhizaZedariae；urul；ED；Antigen；urul-heisuinate莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)uruaphaeaulisVal.、廣西莪術(shù)uruakangsiensisS.G.Leeet.F.Liang或溫郁金uruaenyujinY.H.henet.Ling的枯燥根莖，后者習(xí)稱“溫莪術(shù)。中醫(yī)理論認(rèn)為莪術(shù)辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，具行氣破血，消積止痛之成效1。莪術(shù)醇urul，又名姜黃環(huán)醇，是從莪術(shù)揮發(fā)油中提取出來的倍半萜類化合物，莪術(shù)醇是莪術(shù)油中有效成分之一，其藥理作用主要集中在抗癌，抗菌和抗病毒等方面；莪術(shù)醇可作為莪術(shù)及莪術(shù)油質(zhì)量評價根據(jù)之一2；目前檢測莪術(shù)醇的

5、方法主要有比色法、紅外分光光度法、雙波長薄層掃描法、氣相色譜法3。比色法特異性不強，易受其他因素的影響；后幾種儀器檢測法都需要特定的儀器，對測定樣品的前處理復(fù)雜，檢測本錢高，均不合適大批量樣品的準(zhǔn)確測定，故需要一種高效、快速、便捷的檢測方法?；诳乖贵w反響的酶聯(lián)免疫吸附測定enzye-linkediunsrbentassay，ELISA具有快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便，本法合適大規(guī)模檢測，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、激素及其他化學(xué)污染物、殘留物的檢測；國內(nèi)外有文獻報道用該法研究藥用植物中活性成分410，同時顯示了該技術(shù)的許多優(yōu)點和用處。莪術(shù)醇酶免疫吸附測定方法的建立在藥物研發(fā)過程中藥代動力學(xué)的

6、研究及天然資源的挑選，藥物消費過程中包括種植、組織培養(yǎng)的在線監(jiān)測、藥品流通和使用過程中批量樣品的質(zhì)量檢測等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。應(yīng)用ELISA法必須有相應(yīng)的抗體，莪術(shù)醇是小分子半抗原，本身不具有誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的才能，為此須將莪術(shù)醇小分子以半抗原的形式與相對分子量大的載體蛋白偶聯(lián)制備成全抗原。本實驗以莪術(shù)醇和琥珀酸酐為原料，在4-二甲基氨基吡啶DAP催化下，先合成半抗原莪術(shù)醇琥珀酸單酯ur.-HS，再用1-乙基-33-二甲基氨基丙基碳二亞胺ED縮合法將ur.-HS與牛血清白蛋白bvineserualbuen，BSA偶聯(lián)，合成人工抗原ur.-HS-BSA，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間-質(zhì)譜A

7、LDI-TF-S技術(shù)對上述復(fù)合物進展了鑒定并計算出結(jié)合比，為莪術(shù)醇單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫吸附測定法的建立打下了基矗1儀器與材料1.1儀器透析袋華美生物工程公司，Siga公司進口分裝、超導(dǎo)核磁共振儀(AVANEAV500，Bruker)、質(zhì)譜分析儀SHIADZUQP5050A，日本、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀JSELITE，日本JEL公司、微量移液槍德國普蘭德、電子天平P225D，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)、集熱式恒溫磁力攪拌儀DF-101S鞏義市英裕予華儀器廠。1.2藥品莪術(shù)醇上海滬云醫(yī)藥開發(fā)，批號：070518，98%HPL、丁二酸酐P,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司、牛血清白蛋白BSA，R

8、IA級Siga公司、1-乙基-33-二甲基氨基丙基碳二亞胺EDSiga、4-二甲基氨基吡啶DAP、吡啶、乙醚、三氯甲烷、石油醚、醋酸乙酯、乙腈、三氟醋酸TFA、芥子酸，均為分析純。2方法與結(jié)果2.1莪術(shù)醇琥珀酸單酯ur.-HS合成11和鑒定取10l三氯甲烷置于反響瓶，參加少量無水gS4，攪拌過夜，濾除去gS4，取濾液，參加莪術(shù)醇0.1170g0.495l、丁二酸酐0.12g1.2l，攪拌溶解，參加適量DAP，于65回流，TL監(jiān)測反響進度，反響完畢，冷卻，將反響物傾入冰水中，用乙醚萃取，合并有機相，用無水Na2S4枯燥后，回收有機溶劑，得粗品，用硅膠柱層析石油醚乙酸乙酯81，V/V，得純度較高的

9、莪術(shù)醇丁二酸單酯油狀物0.1450g，產(chǎn)率87。莪術(shù)醇13-NR：12.34，21.46，23.04，28.71，30.92，38.84，39.39，54.50，56.33，88.09，104.53，112.82，144.76。莪術(shù)醇琥珀酸單酯SAPI/z：337.14(-)；13-NR：11.62，20.90，22.21，28.71，29.13，30.2，30.80，39.12，52.58，54.35，89.33，108.67，112.51，144.83，169.15，172.55。2.2莪術(shù)醇人工抗原的合成12ur.-HS-BSA合成：稱取4.15g12.310-6l莪術(shù)醇丁二酸單酯，加吡

10、啶H211,V/V溶液250l，攪拌溶解；稱取BSA2.8g，參加碳酸鈉緩沖液250l，攪拌溶解，參加ED4.7g24.610-6l，將莪術(shù)醇丁二酸單酯的吡啶水溶液參加前反響液中，于室溫反響15h。裝入透析袋，用純潔水于4透析，每5h換水1次，透析3d，經(jīng)冷凍枯燥，得1.60gur.-HS-BSA，產(chǎn)率52。于-20下保存。2.3利用ALDI-TF-S鑒定莪術(shù)醇人工抗原2.3.1基質(zhì)輔助溶液的配制將0.15三氟醋酸TFA666l加到乙腈H3N333l中，取10g芥子酸參加前配0.15TFA-H3N混合液1l，超聲1015in后溶解，備用。2.3.2供試品處理取ur.-HS-BSA，溶解在8l/

11、L的尿素溶液中，然后將其稀釋成濃度在110pl/L；另稱取BSA0.5g溶于水100l，配成5g/lBSA水溶液。2.3.3ALDI-TF-S測定各取供試品和基質(zhì)輔助溶液1l，充分混勻，汲取混合溶液1l滴加在鍍金樣品板上，室溫下晾干后，送入質(zhì)譜儀分析。結(jié)合比偶聯(lián)物相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量/莪術(shù)醇相對分子質(zhì)量結(jié)合比73302.366713.4/336.4219.6轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4莪術(shù)醇琥珀酸單酯ur.-HS構(gòu)造確實定用S譜和13-NR譜確定ur.-HS的構(gòu)造。從ur.-HS的SAPI/z：337.14-，推出其分子量為336，初步認(rèn)為ur.-HS為合成的目的產(chǎn)物；再分別測出原料

12、莪術(shù)醇、ur.-HS的13-NR譜，比擬ur.-HS的13-NR與原料莪術(shù)醇的13-NR不同，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物多出172.48，169.15，30.2，29.13，共4條譜線，其中169.15為莪術(shù)醇成丁二酸單酯后酯羰基碳原子，172.48為莪術(shù)醇成丁二酸單酯鏈羧基羰基碳原子，而29.13，30.2，為丁二酸單酯鏈中的2個亞甲基碳原子。結(jié)合S的數(shù)據(jù)，對原料莪術(shù)醇和合成出的產(chǎn)物的碳譜的化學(xué)位移數(shù)據(jù)的差異分析說明，從而確定合成出的產(chǎn)物就是所要合成的目的產(chǎn)物ur.-HS。2.5ur.-HS-BSA的ALDI-TF-S分析根據(jù)ALDI-TF-S圖譜見圖12，可以明晰地判斷出ur.-HS與BSA偶聯(lián)形成了新的復(fù)

13、合物，該復(fù)合物的相對分子質(zhì)量約為73302；比照BSA的相對分子質(zhì)量66713以及ur.-HS的相對分子質(zhì)量336,可以求出ur.-HS-BSA的結(jié)合比為19.6，本實驗中人工合成的半抗原-蛋白復(fù)合物ur.-HS-BSA的結(jié)合數(shù)值較大，每個載體蛋白分子平均與19.6個半抗原分子結(jié)合，說明半抗原與載體的偶聯(lián)情況良好，這為后續(xù)的抗url抗體的制備提供了可靠的試驗基矗3討論莪術(shù)醇為小分子天然化合物，相對分子量236.35，僅具有反響原性，需要與大分子蛋白質(zhì)等偶聯(lián)形成復(fù)合物后才有免疫原性，但小分子化合物必須具有或衍生出能與載體進展交聯(lián)反響的功能基團如氨基、羧基、重氮基等，才能與載體交聯(lián)；對含羥基的半抗

14、原，需要將其羥基衍生為羧基再與蛋白質(zhì)載體交結(jié)合成人工抗原。根據(jù)莪術(shù)醇構(gòu)造中存在6羥基的特點，先將莪術(shù)醇與琥珀酸酐反響，接上一個琥珀酸臂成中間體ur.-HS，從而在6位羥基上引入一個羧基，進而與BSA的氨基通過酰胺鍵相連，生成ur.-HS-BSA蛋白復(fù)合物。ur.-HS的合成條件較溫和，在DAP催化下產(chǎn)物很容易得到，且產(chǎn)率較高。將含羧基的半抗原與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)常采用混合酸酐法、活潑酯法或碳化二亞胺法。本實驗用ED作縮合劑，ur.-HS和BSA交聯(lián)形成抗原的反響條件較溫和，在常溫下就能進展。目前對人工合成抗原多采用物理化學(xué)方法對其進展鑒別，主要有紫外光譜法、紅外光譜法、核磁共振法、質(zhì)譜法等。本實驗利用生物質(zhì)譜ALDI-TF-S技術(shù)來鑒定出ur.-HS-BSA蛋白復(fù)合物，分別測出ur.-HS-BSA和BSA的相對分子質(zhì)量，通過對BSA和ur.-HS-BSA相對分子質(zhì)量的比擬，確定ur.-HS與BSA偶聯(lián)成功。由于人工抗原中載體蛋白