免疫組化染色的常見問題及定量分析

1、免疫組化染色的常見問題、激光顯微切割及冰凍切片北京腫瘤醫(yī)院 病理科董彬免疫組化原理和方法定義：組織化學HistochemistryDealing with identification of chemical components in cells and tissues. 概念： 利用已知的特異性抗體與抗原能特異性結(jié)合這一特點，通過化學反應(yīng)，使標記于特異性抗體上的顯示劑顯色，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細胞結(jié)構(gòu)，了解抗原表達情況的一門組化技術(shù)。 原理： 利用抗原抗體能夠特異性結(jié)合這一原理，從而在組織細胞水平進行抗原抗體反應(yīng)。一抗的類別蛋白質(zhì)肽類酶類激素類糖類脂質(zhì)類抗原 顯示劑 酶金屬離子

2、同位素 熒光分子底物 DAB(3,3-二胺基聯(lián)苯胺) AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑) 堅牢藍 核固紅免疫組化的優(yōu)點 特異性強 ：抗原與抗體的“一對一”的特異結(jié)合，僅當組織細胞中存在交叉抗原時會出現(xiàn)交叉反應(yīng) 。敏感性高 定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合 免疫組化技術(shù)操作上的優(yōu)點方法簡單，易掌握在組織切片原位顯示抗原的表達情況試驗條件要求不高，絕大多數(shù)實驗室都可滿足其需要。不需要特殊、貴重的儀器。免疫組化染色的缺點為半定量分析，不能進行定量分析。受實驗者技術(shù)水平影響較大。結(jié)果判定主觀性較強。步驟二甲苯脫蠟 302梯度酒精復(fù)水（100%2，95%，90%，85%，每次5，蒸餾水）雙氧水阻斷非特異性過氧

3、化物酶（0.3%-3%）抗原修復(fù)（酶，微波，高壓鍋）二抗同種屬血清封閉抗原非特異性表達（BSA，山羊血清）一抗4過夜復(fù)溫二抗DAB顯色蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，流水返藍脫水、透明，中性樹膠封片染色中各步驟注意事項及原理前期處理染色后期處理 前期 不可控制因素：取材、固定、脫水、透明、浸蠟，包埋可控制因素： 撈片：注意不要太靠近一側(cè)，必要時用鑷子壓住組織片控水 染色過程中的影響因素阻斷非特異性過氧化物酶抗原修復(fù)封閉抗原非特異性表達一抗二抗DAB顯色 內(nèi)源性HRP的消除 分布: 腦， 脾，中性WBC， 巨噬細胞。 血紅蛋白和肌紅蛋白含有鐵卟啉具有內(nèi)源 性HRP活性內(nèi)源性HRP的消除:3% H2O2

4、, 5-100.3% H2O2甲醇溶液, 15-600.1% HCl 酒精溶液, 300.2% 醋酸甲醇溶液, 300.01% 過碘酸 5-10, 0.1% 硼酸鈉 10抗原修復(fù) 甲醛固定過程中形成醛鍵而封閉了部分抗原決定簇甲醛在保存進程中會形成羧甲基，而封閉抗原決定簇在用固定劑固定時，會使蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，也可能會封閉抗原決定簇 抗原修復(fù)方法 化學方法物理化學方法化學方法一.胰蛋白酶(tyrpsin)消化方法：1.配制： 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1, PH78的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可用。2.消化條件和時間：將切片放置在濕盒內(nèi)，3710一40

5、min，一般為20 min即可。二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法 1.配制：0.4胃蛋白酶，用0.1mol/L的Hcl配制。2.消化時間：3720 min。3.用途：主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示，如纖粘素、膠原酶等 三鏈霉蛋白酶消化方法 四無花果蛋白酶消化方法 五. 菠蘿蛋白酶消化方法 六尿素消化方法 物理化學方法 單純加熱方法 ：將片子放入盛有抗原修復(fù)液的容器中，置電護上加熱至沸騰，并持續(xù)10min。微波方法：將片子放入盛有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱使溫度保持在92100?？倳r間10min，但必須有間隔。 高壓鍋免疫組化抗原修復(fù)程序切片放在 染色架上(不宜太密)高壓鍋加入0.01M

6、枸櫞酸鈉緩沖液3L， 染色放在枸櫞酸鈉緩沖液內(nèi)， 加蓋，煮沸，冒氣后，加上限壓閥加壓1-5（通常選擇2分鐘）晾涼取出檸核酸鹽緩沖液的配制 A液：稱取2101g檸檬酸溶于1000 ml蒸餾水中。B液：稱取2941g檸檬酸鈉溶于1000 ml蒸餾水中。工作液：取9mlA液和41 mlB液，加入450 ml蒸餾水，調(diào)PH6.0士0.1?？贵w的保存和配制抗體的保存*分裝, 低溫, 避免反復(fù)凍融*硅化, 防止蛋白吸附*防止交叉污染和細菌污染分裝 按5l或10 l分裝，并注明標記(批號、名稱、效價、量)，密封。故入-20一-40冰箱中保存?zhèn)溆茫话憧杀４?2年。PBS稀釋的抗體不能長時間保存，在4可放13

7、天，超過7天效價顯著降低。避免反復(fù)凍融而使抗體效價降低 即用型抗體 一般4保存效價穩(wěn)定在一年以上抗體的配制 根據(jù)說明書推薦濃度，進行倍比稀釋自制抗體根據(jù)酶標結(jié)果，進行倍比稀釋。最好采用抗體稀釋液進行稀釋，如無抗體稀釋液，可采用PBS進行稀釋。其他準備工作中的注意事項蓋玻片需過酸3-5分鐘，流水沖洗1小時以上 蓋玻片的儲存：浸泡于95-100%的Alc中，隨用隨擦，注意沖洗好的蓋玻片呈無色或淡藍色，如發(fā)黃請重新沖洗干凈。 用廢白衣擦蓋玻片效果較好 配制緩沖液 注意桌面和濕盒的情況，如不平可用紙 墊平 免疫組化染色不理想的處理 非特異性染色的消除最大限度稀釋抗體修改封閉方法*二抗同種屬正常血清阻斷

8、， 很多背景染色深的原因是正常動物血清使用不合理，如第二抗體為羊抗鼠IgG，應(yīng)該用羊的正常血清。*羊血清*BSA阻斷*羊血清+BSA* 5%脫脂奶DAB顯色過程中的問題DAB顯色：一般2-5分鐘，最多不要超過10分鐘DAB顯色過快，少于一分鐘時，注意一次顯色的片子不要超過5張。注意DAB渣子的問題，配好的DAB顯色液應(yīng)為清亮，微帶煙色，如看到顆粒樣物或呈棕色，應(yīng)予以過濾抗原的“例外”表達 細胞的分化不同階段其抗原性有相應(yīng)變更，可解釋這些抗原的“例外”表達。 出現(xiàn)背景著色的其他幾種原因 內(nèi)源性過氧化物酶沒有完全阻斷。脫蠟不夠徹底。組織粘貼劑使用不當或太濃。PBS沖洗不夠?？贵w稀釋不合理，濃度太高

9、底物顯色時間太長。染色背景過深的處理采用不同的封閉方法，直至5%的脫脂奶。梯度稀釋一抗，降低一抗?jié)舛?，選擇最適的抗體稀釋度。特異性差的處理選擇相應(yīng)比較合適的抗體稀釋度，延長一抗4孵育時間，必要時可以采用4 2-3天。假陽性的原因 抗體與多種抗原有交叉反應(yīng)抗體與組織中某些成分的非特異性結(jié)合 內(nèi)源性酶的顯色腫瘤或病變中有其他組織殘留，尤其是腫瘤中殘余極少的正常組織，而正常組織此時又有一定程度的增生或萎縮時，易將其誤認為腫瘤成分抗原的彌散或被瘤細胞吞噬而使抗原在不該出現(xiàn)的部位出現(xiàn)，如何杰金病Rs細胞中的免疫球蛋白異位抗原的表達， 假陰性的原因 (1)抗體己失活、濃度不當或抗體本身達不到應(yīng)有的敏感度，

10、不論是自產(chǎn)抗體、國外贈送的抗體還是商品化的抗體，都會有抗體不能顯示相應(yīng)抗原的現(xiàn)象(2)抗原丟失或減弱，當標本處理不當時更容易出現(xiàn)，如固定不良、溫度過高(3)操作步驟不當，即純技術(shù)上的失誤，如反應(yīng)時間不夠或過久、洗脫不夠等。陰性染色的處理抗原修復(fù)方法是否正確一抗?jié)舛仁欠襁^低，適當提高一抗?jié)舛纫豢故欠窨煽抗潭ê蜏囟?。許多抗體不適合用于福馬林固定的組織，僅適合于冰凍切片 注意：整個操作過程中注意一定要避免干片！免疫組化的精髓是低濃度，長時間！復(fù)染 每次復(fù)染前需用報紙清潔蘇木素染液表面的浮渣，如蘇木素已使用時間較長可用濾紙過濾。復(fù)染時間一般1-2分鐘即可。 必須進行復(fù)染，否則會影響結(jié)果的觀察。分色的問

11、題分色液通常采用0.5-2%的鹽酸酒精，分色時間應(yīng)根據(jù)切片脫色程度而定，但最長不超過1分鐘，如果一分鐘分色仍無效果，建議更換分色液。復(fù)染后的免疫組化切片必須經(jīng)過分色，否則會影響陽性結(jié)果的判斷。封片的問題手工封片一定要注意封片膠的用量，切勿使用太多。 對照陽性對照， 陰性對照空白對照， 替代對照自身對照， 平行對照 結(jié)果判斷背景干凈, 定位準確判定標準 紀小龍在1996年版的診斷免疫組織化學P25提出：間質(zhì)清晰，無背景著色，同時陽性細胞要在5%以上，才能定為陽性。目前通常以陽性細胞占所有細胞的10%以上定為陽性，僅散在表達或表達量低時，才選擇5%陽性為陽性標準。根據(jù)染色的強度，分為+，+，+。乳

12、腺癌Her2染色結(jié)果判讀 乳腺癌必須滿足細胞膜染色形態(tài)、強度及百分比陽性腫瘤細胞（超出10%）閾值標準，才被視為Her2蛋白過表達陽性。染色必須定位于細胞膜與圓周（完整染色）。羅氏公司VENTANA HER2判讀指南染色情況 評分（報告至臨床醫(yī)生） Her2染色評估 未見膜染色 0陰性腫瘤細胞呈現(xiàn)弱至中度完整的細胞膜染色 1+陰性大于10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)弱至中度的完整的細胞膜染色 2+可疑大于10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強且完整的細胞膜染色 3+陽性切片的觀察閱片忌先用高倍鏡。一定要遵循先低倍后高倍的原則貼簽 注明病理號，所用一抗名稱，抗體稀釋度，染色日期 PALM激光顯微切割系統(tǒng)是由德國PALM公司

13、研發(fā)的一套高級精確的實驗室設(shè)備。利用337納米的紫外激光對顯微鏡下的生物樣本 (組織、細胞簇、單細胞、染色體及染色體片斷等）進行切割和分離。在病理學、遺傳學和腫瘤學等多個科研領(lǐng)域得到非常廣泛的應(yīng)用。PALM激光顯微切割系統(tǒng)簡介 1、精確 其切割精度可達1個微米, 完全可以勝任染色體級別的切割操作,是同類產(chǎn)品中唯一可以切割染色體的系統(tǒng)。 2、安全 由于采用了337納米的安全紫外激光,不會對生物樣本造成損害和變異, 同時避免了紅外光的熱效應(yīng)。 PALM激光顯微切割系統(tǒng)的優(yōu)點: 3、高純度 采用了PALM公司的LPC (激光彈射收集）技術(shù), 對目標先進行切割, 然后發(fā)射一個激光脈沖, 把目標向上彈射

14、, 進入收集裝置。整個過程簡單, 沒有任何機械接觸, 無污染, 不需要特殊耗材。 4、人性化操作 一個好的工具在操作上應(yīng)該是簡單合理的。PALM通過一個智能化軟件PALM Robot可以完成所有的切割工作, 也就是說所有的工作都用鼠標完成。一個熟練的操作者完成一個操作只需要幾十秒的時間。 5、靈活 PALM的操作可以將整個片子上所有感興趣的區(qū)域標記出來, 然后點擊切割按鈕, 從切割到收集一切工作可以自動完成。此外還可以用不同顏色標記出不同種類的細胞, 軟件會自動分次收集同類細胞?？梢宰詣佑嬎愠雒總€區(qū)域的面積。所有的區(qū)域都可以以文件的形式儲存在電腦中, 配合上位置記憶功能, 這樣同一張片子在任何

15、時候都可以拿出來進行分析, 而無需進行繁瑣的重復(fù)性勞動?？梢噪S時將屏幕上的畫面存檔。可以用快捷鍵或鼠標隨時調(diào)節(jié)激光的能量和聚焦位置。 激光顯微切割的缺點未封片的組織切片組織結(jié)構(gòu)較模糊，會影響顯微切割的準確性。在做單細胞顯微切割或亞細胞顯微切割時，易出現(xiàn)鄰近非目的細胞碎片的污染。切片脫水不徹底，或是設(shè)定的激光的能量太低，有時會造成目的細胞無法從切片上彈射下來 。 激光顯微切割技術(shù)的應(yīng)用 DNA分析基因表達分析蛋白質(zhì)分析 單細胞分析 DNA分析 雜合性缺失（LOH） DHPLC 比較基因組雜交（CGH，comparative genomic hybridisation） 基因表達分析 RT-PCR

16、 real time quantitative PCR cDNA array 序列基因表達分析（serial anallysis of gene expression） 單細胞分析 基因突變 病毒DNA序列的插入 免疫球蛋白基因序列重排 蛋白質(zhì)分析 cDNA array 可用如全基因組擴增的模板，得到表達文庫 ABCA: 鏡下選擇病變區(qū)域B：標出所要切割的病變區(qū)域C：切割完畢后鏡下所見冰凍切片的制作及其注意事項冰凍切片冰凍切片（frozen section）是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的方法。 用途因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。顯示

17、組織中的脂肪和脂類物質(zhì)，這常見于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等 。某些酶的顯示如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等。 神經(jīng)病理學技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 對某些物質(zhì)所進行的免疫熒光的研究。 冰凍切片的優(yōu)點： 簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)?？焖?，用時短。組織變化不大。能很好保存脂肪，類脂等成分。能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機溶劑或熱耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。 冰凍切片的缺點 不容易做連續(xù)切片。切取的組織不能過大

18、，組織過大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。不容易制作較薄的切片。組織塊在凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片清晰。組織冰凍切片OCT包埋劑 OCT(optimum cutting temperature)是由高分子聚合物組成的無色透明粘稠液體，驟冷時固化，其冰凍速度和軟硬韌度與組織細胞相近，因而能保證優(yōu)化的OCT溫度，并具有支持填充、減少皺褶和斷裂等作用?？扇我馓砑佑谇衅瑱C的樣品架以支持和固定樣品 。驟冷劑 組織盡可能新鮮、驟冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的驟冷劑有：CO2干冰（78） 丙酮干冰冷卻的輕石油醚、乙烷和庚烷（80） 液氮（190）液氮冷卻的丙烷（19）液氮適用于組織化學，較安全。缺點：組織塊易發(fā)生龜裂。切片前準備提前至少一天預(yù)約。聯(lián)系電話：6737/6715，聯(lián)系人：董彬，張宏。準備切片刀