大鼠肺泡巨噬細胞原代培養(yǎng)技術(shù)的改良措施

1、大鼠肺泡巨噬細胞原代培養(yǎng)技術(shù)的改進措施【摘要】目的改進原代肺泡巨噬細胞(alvelararphage,A)培養(yǎng)技術(shù)，進步A培養(yǎng)效果。方法SD大鼠，在體支氣管灌洗肺獲取A，通過預先注射空氣、14號注射器針頭回收灌洗液、低速離心、種板前屢次吹打等改進措施別離和培養(yǎng)A。倒置顯微鏡連續(xù)觀察A的形態(tài)變化，臺盼藍拒染實驗鑒定A存活率，瑞氏-姬姆薩染色鑒定A純度。結(jié)果A體外培養(yǎng)后40in即見細胞貼壁;23天時，細胞形態(tài)多樣，呈圓形、不規(guī)那么形、梭形等形態(tài)，胞體變大，胞質(zhì)豐富。臺盼藍拒染實驗示A存活率95%，瑞氏-姬姆薩染色示A純度95%。結(jié)論本實驗改進了原代A培養(yǎng)的技術(shù)方法，進步了原代A培養(yǎng)效果?！娟P(guān)鍵詞】

2、肺泡巨噬細胞;細胞培養(yǎng);技術(shù)改進Abstrat:bjetiveTdifythetehniquesfrpriaryulturefhighlypurifiedthepriaryratalvelararphages(As).ethdsAsereislatedinvivandulturedithsuhdifiedtehniquesaspre-injetinfairandrelaatinfbrhalvelarlavagefluidith14-buglesyringeneedle,l-speedentrifugatinandulti-blingbefreplatingn6-ellultureplates.

3、Therphlgialhangeserebservedundertheinvertedirspe.Theellsurvivalrateasdetetedithtrypanbluedyeexlusintest,andellpurityasdeterinedbyright-Giesastaining.ResultsInvitr,Asadheredtplastisurfaeithin40in;2-3dayslater,ellrphlgypresentedixedshapes,i.e.,irular,irregularandspindleshapes.Thetrypanbluetestshedasur

4、vivalrate95%ftheAsandright-Giesastainingindiatedapurity95%ftheAs.nlusinThedifiedtehniqueseplyedinurexperienthadbetterresultsfrtheislatinandpriaryulturefAs.Keyrds:alvelararphage;ellulture;tehniquedifiatin肺泡巨噬細胞(alvelararphage，A)分布于呼吸道-肺泡外表，是肺部抗感染的第一道防線,是肺部抵抗病原感染的重要組成局部。A不僅具有吞噬和抗原遞呈功能，而且還能分泌多種生物活性物質(zhì),對

5、急性肺損傷的發(fā)生、開展及轉(zhuǎn)歸具有重要影響1-3，因此，A一直是研究肺部抗感染模型的重要細胞類型。但由于在別離培養(yǎng)原代A過程中存在獲取率低、混雜紅細胞、容易污染損傷、不易貼壁等技術(shù)難題4，目前國內(nèi)外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬細胞株H-S5、大鼠肺泡巨噬細胞株NR83836等細胞株替代原代A，然而A細胞株與原代培養(yǎng)的A在細胞形態(tài)、細胞活力及細胞生理等方面存在明顯差異。因此，優(yōu)化原代A培養(yǎng)技術(shù)從而得到理想的A對研究肺部感染性疾病發(fā)活力制有很重要的作用。本研究討論A培養(yǎng)技術(shù)的改進措施及考前須知。1材料和方法1.1材料1.1.1動物安康雄性SD大鼠，體重200250g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。1.

6、1.2主要試劑和器材DE(低糖)培養(yǎng)基(Gib公司)，胎牛血清(杭州四季青)，青霉素、鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份)，PBS(北京中杉金橋生物技術(shù))，臺盼藍染液(Siga公司)，瑞氏-姬姆薩染液(南京建成科技)，細胞培養(yǎng)箱(美國TherFisherSientifi)，超凈工作臺(蘇州凈化設備)，倒置顯微鏡(日本ti公司)，離心機(美國Bekan公司)。1.2方法1.2.1A的別離培養(yǎng)在參考郭曉芳等7-8別離A技術(shù)的根底上，我們對別離A的方法加以改進。SD大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，引頸處死;在75%乙醇中浸泡消毒12in，移到超凈工作臺上，仰臥于小手術(shù)臺上，固定頭尾;翻開胸腔，暴露肺;暴露

7、頸部氣管，用14號注射器針頭從頸部正中線切口行氣管插管，用4-0的手術(shù)縫合線結(jié)扎固定8-9。用冷PBS在體氣管灌洗肺，同時按摩肺，每次510l，灌洗10次，灌洗液回收率為90%。灌洗液經(jīng)200目細胞篩過濾，1000r/in低速離心10in，棄上清，再用PBS洗滌2次，參加含10%胎牛血清的DE培養(yǎng)液重懸沉淀細胞制成單細胞懸液。在倒置顯微鏡下進展細胞計數(shù)和臺盼藍拒染試驗檢測細胞活力，調(diào)整細胞密度為1109個/L，將其接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。在37、5%2濃度的培養(yǎng)箱中孵育12h，棄上清，用PBS洗板2次去除非貼壁細胞，重新參加含10%胎牛血清的新穎DE培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，23天更換培養(yǎng)液。

8、1.2.2臺盼藍拒染實驗將0.4%的臺盼藍染液10與等體積單細胞懸液混合，染色23in,取1滴混合懸液于細胞計數(shù)器內(nèi)。鏡下觀察可見，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染，計數(shù)藍染細胞和未藍染細胞。細胞存活率按以下公式計算:細胞存活率(%)=未染色細胞/(藍染細胞+未染色細胞)100%。1.2.3瑞氏-姬姆薩染色取5l單細胞懸液于載玻片上，制成涂片。待涂片晾干后，按瑞氏-姬姆薩染液試劑盒說明書操作。染色完成后，在倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況，鑒定單細胞懸液中A純度。計算公式如下：細胞純度(%)=著色巨噬細胞數(shù)/細胞總數(shù)100%2結(jié)果2.1顯微鏡觀察結(jié)果單細胞懸液中A呈圓形，透亮，培養(yǎng)40in后可觀察

9、到呈橢圓形、三角形或不規(guī)那么形的貼壁細胞，胞質(zhì)豐富;2h后細胞貼滿培養(yǎng)皿底部，細胞呈星形，有許多偽足和突起(圖1A);培養(yǎng)23天后，細胞形態(tài)多樣，呈圓形、不規(guī)那么形、梭形等形態(tài)，胞體變大，胞質(zhì)豐富(圖1B)，此時細胞處于對數(shù)期，合適進展實驗研究。圖1A的形態(tài)學變化(300)轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.A.肺泡巨噬細胞貼壁2h;B.肺泡巨噬細胞貼壁2天2.2臺盼藍拒染實驗結(jié)果大多數(shù)細胞呈圓形透亮存活狀態(tài);極個別細胞破壞死亡，臺盼藍進入細胞核內(nèi)呈藍染狀(圖2)。肺泡巨噬細胞的存活率95%。2.3瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果A胞質(zhì)呈灰色，胞質(zhì)顆粒呈細小淡紫紅色，核呈紫紅色;同時可見核呈紫紅色、胞質(zhì)呈淺紅色并有淡紫

10、紅色顆粒的中性粒細胞。A細胞純度95%(圖3)。圖2肺泡巨噬細胞臺盼藍染色(400)圖3肺泡巨噬細胞瑞氏-姬姆薩染色(600)3討論目前原代A培養(yǎng)在別離、培養(yǎng)過程中存在多種技術(shù)難題。在別離A時，本實驗運用了多種改進措施，獲得了滿意的效果：灌洗前一定要把肺內(nèi)血液驅(qū)除徹底，減少灌洗液中紅細胞數(shù)量，減少雜質(zhì);重懸細胞單細胞懸液時，要充分吹打細胞使之分散均勻，利于細胞貼壁;PBS洗板及給細胞換液時，動作要緩慢，以免貼壁細胞脫壁，影響搜集肺泡巨噬細胞的數(shù)量。為了保持培養(yǎng)的原代A的活力，在別離和培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，本研究采取了以下措施:大鼠麻醉處死后到灌洗肺的時間應盡量縮短，以免時間過長影響細胞活力，整個過程要在

11、冰浴上進展，放置時間過長、溫度過高將導致細胞死亡;大鼠浸泡乙醇消毒時，盡量在呼吸停頓后浸泡，防止由于誤吸乙醇破壞A;采用低速離心方法別離A，防止破壞細胞構(gòu)造，影響細胞活力;A種板時參加10%胎牛血清可以促進細胞貼壁，增加細胞活力，促使細胞恢復其原來生理狀態(tài);在實驗前去除血清，增加A對藥物的敏感性。另外，在培養(yǎng)細胞過程中，菌室和超凈臺要常規(guī)消毒，整個過程要注意無菌操作，防止細胞污染。綜上所述，本實驗采用以上改進措施后，經(jīng)臺盼藍拒染試驗及瑞氏-姬姆薩染色方法鑒定，可以得到大量純度高、活性好的A，為開展大鼠肺泡巨噬細胞的生物學功能及細胞生理、病理模型研究奠定了良好基?！緟⒖嘉墨I】1AsehnuneK

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