聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase chain reaction, PCR1一、什么是PCR？ PCR是一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)，用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。 2二、PCR技術(shù)的誕生和發(fā)展1869年 Friedrich Miescher 發(fā)現(xiàn)DNA。1953年 Waston和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。1958年 Matthew Meselson和Franklin Stahl論證 了DNA的半保留復(fù)制方式。1960s中期從細(xì)胞中分離基因 。1960年代末和70年代初基因的體外分離技術(shù)。1985年 美國(guó)PE-cetus公司的人類(lèi)遺傳研究室的 mullis

2、等人發(fā)明了PCR技術(shù)。3三、PCR技術(shù)的原理 加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物重復(fù)上述變性退火引物延伸過(guò)程至25-40個(gè)循環(huán)。靶序列被擴(kuò)增上百萬(wàn)倍，達(dá)到體外擴(kuò)增核酸序列的目的。4PCR原理示意圖模板DNA加熱，變性DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA 溫度下降，退火5引物與模板DNA雜交引物延伸形成兩條與模板DNA完全一致的DNA鏈經(jīng)過(guò)若干個(gè)循環(huán)后，模板DNA大量擴(kuò)增6四、PCR反應(yīng)基本條件PCR反應(yīng)基本要素：模板DNA、引物、酶、 dNTP、Mg2+ 、緩沖體系71. DNA模

3、板來(lái)源廣泛，容易獲得；模板用量較少；純度要求較低；純化方法較簡(jiǎn)便；純化目的：除去影響PCR反應(yīng)的雜質(zhì)，暴露模板DNA。8傳統(tǒng)的DNA純化方法：采用去垢劑破壞細(xì)胞組份，蛋白水解酶消化去除蛋白質(zhì)，最后用有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜成分，用乙醇沉淀核酸?？焖俚腄NA純化方法：用高溫低滲液體（如水煮沸）溶解細(xì)胞，直接用于PCR擴(kuò)增。92.引物Primer 引物（primer）是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR的效率和特異性取決于兩個(gè)方面，一是引物與模板DNA的特異結(jié)合；二是多聚酶對(duì)引物的有效延伸。 設(shè)計(jì)引物的總原則：提高擴(kuò)增的效率和特異性。10引物設(shè)計(jì)基本原則引物長(zhǎng)度：一般以1530bp為宜引物擴(kuò)增跨度：

4、一般以200500bp為宜引物堿基分布：盡可能隨機(jī)引物堿基G+C含量：宜在45%55%左右11引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)引物的特異性引物3末端的堿基與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)3末端的末位堿基最好選T、C、G，而不選A12引物5末端的堿基沒(méi)有嚴(yán)格的限制引物中最好能加上合適的酶切位點(diǎn)引物濃度：一般為0.10.5mol/L，以產(chǎn)生所需要結(jié)果的最低引物量為好133. 脫氧核糖核苷三磷酸dNTP使用濃度為20-200mol/L最低的適宜dNTP濃度可根據(jù)特定靶序列長(zhǎng)度和堿基組成來(lái)確定。四種dNTPs的濃度應(yīng)相同。dNTP溶液具有較強(qiáng)的酸性，通常把dNTP配成510mmol/L貯存液，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝

5、后-20凍存 。144. Taq DNA聚合酶 最早用于PCR反應(yīng)的酶是Klenow酶缺點(diǎn)：熱穩(wěn)定性差； 酶反應(yīng)溫度偏低?，F(xiàn)在都用Taq DNA聚合酶，具有良好的熱穩(wěn)定性。濃度：1-2.5U/1001時(shí)效果最佳。15目前主要有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)：從棲熱水生桿菌中提純的天然酶大腸桿菌合成的基因工程酶165. Mg2+ Mg2+的作用：為DNA聚合酶活性所必需。Mg2+的濃度：一般為1.52.0mmol/L，對(duì)應(yīng)dNTP濃度為200mol/L左右。注意：所制備的模板DNA中不應(yīng)含有高濃度的螯合劑如EDTA，也不應(yīng)含有高濃度的帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)，如磷酸根。176.擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液 最為常用的

6、緩沖體系是1050mmol/L Tris-HCl(pH8.38.8，20)。反應(yīng)混合物中50mmol/L以?xún)?nèi)的KC1有利于引物退火.小牛血清白蛋白(100g/ml)或明膠(0.01%)或Tween 20(0.05%-0.1%)有助于Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定。在反應(yīng)體系中加入適量（10%）二甲亞砜（DMSO）可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。18五、PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)1. 變性溫度與變性時(shí)間 一般情況下，94 1min可使起始模板完全變性。 溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成損害。192. 退火溫度與退火時(shí)間 退火溫度影響著PCR反應(yīng)的特異性，主

7、要取決于引物的長(zhǎng)度及G+C含量。 引物的長(zhǎng)度在1525bp之間時(shí)，退火溫度可通過(guò)計(jì)算得到：Tm=4（G+C）+2（A+T） 203.延伸溫度與延伸時(shí)間溫度：建議選擇在7075之間，此時(shí)，Taq DNA聚合酶具有最高活性。溫度過(guò)高不利于引物和模板結(jié)合。時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定。72 時(shí)核苷酸摻入率為35100個(gè)核苷酸/秒。214.循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定著擴(kuò)增程度。在其它參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的初始濃度。在初使模板DNA為3105，1.5104，1103和50拷貝分子時(shí)，其循環(huán)數(shù)可分別為2530，3035，3540，4045。循環(huán)次數(shù)越多非特異性產(chǎn)物的量亦增加。2

8、25、擴(kuò)增反應(yīng)曲線 圖1 指數(shù)增長(zhǎng)曲線 圖2 非指數(shù)形式增長(zhǎng)y=A2n y=A(1+R)ny為產(chǎn)物量； n為循環(huán)數(shù)； A為起始模板量；R為擴(kuò)增效率。 ynyn23理論上PCR擴(kuò)增效率應(yīng)為100%在PCR反應(yīng)的后期，由于DNA聚合酶活性降低，模板拷貝數(shù)大量增加，引物及dNTPs量被大量消耗及模板互補(bǔ)鏈之間退火逐漸增加，PCR擴(kuò)增效率下降，PCR產(chǎn)物的指數(shù)形式增長(zhǎng)也逐漸變?yōu)榫€性增長(zhǎng)直至出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)。通過(guò)Y=A(1+R)n式估算PCR產(chǎn)物的量。24六、結(jié)果分析 瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物 的大??；點(diǎn)雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型(如，HLA-DQ分型)；Southern雜交分析可從

9、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測(cè)的特異性與敏感性。PCR-ELISA，PCR-EIA，PCR-OLA等均有助于產(chǎn)物的精確分析。25PCR反應(yīng)的特點(diǎn)：1. 高度的特異性 2. 高度的敏感性 3. 操作簡(jiǎn)便快速4. 適用樣品的廣泛性26PCR反應(yīng)的自動(dòng)化Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使PCR的自動(dòng)化成為可能。1988年，PE-cetus公司推出第一臺(tái)PCR擴(kuò)增儀。1995年，定量PCR儀出現(xiàn)。27常用的PCR擴(kuò)增儀形式機(jī)械手：用3個(gè)不同溫度的水浴，樣品用一個(gè)機(jī)械手臂控制在不同溫度間移動(dòng)。優(yōu)點(diǎn)：溫度轉(zhuǎn)換快，耗時(shí)少； 設(shè)備較簡(jiǎn)單，容易控制和維修 28空氣加熱/光加熱循環(huán)裝置： 用熱空氣槍借空

10、氣作為熱傳播媒介或用光照射加熱，由風(fēng)扇提供外部冷空氣，加上精確的溫度傳感器構(gòu)成不同的溫度循環(huán)。優(yōu)點(diǎn)：不用金屬精密加工，成本低； 整個(gè)系統(tǒng)沒(méi)有液體流動(dòng)及制冷劑， 安全程度高。29變溫金屬塊作恒溫裝置： 通過(guò)半導(dǎo)體加熱和冷卻，在一個(gè)鋁合金金屬塊上來(lái)完成PCR過(guò)程。優(yōu)點(diǎn)：裝置比較牢固耐用； 溫度變換平穩(wěn)，有利于保持 Taq DNA聚合酶的活性。30313233PCR技術(shù)的應(yīng)用34 遺傳性疾病的基因診斷 例如：地中海貧血 1 2 3 41.正常內(nèi)對(duì)照2.Basts水腫標(biāo)本3.反應(yīng)體系故障擴(kuò)增失敗4.分子量標(biāo)準(zhǔn)PCR用于-地貧Basts水腫產(chǎn)前診斷35病原體的檢測(cè)例如：人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）等的檢測(cè)。 病毒性疾病的早期診斷對(duì)該疾病的防治十分重要。 PCR方法能從具有大量宿主核酸存在的條件下，特異性擴(kuò)增病毒DNA核酸序列而加以檢測(cè)，敏感性與特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)常規(guī)檢測(cè)方法。36檢測(cè)癌基因和抑癌基因例如：ras癌基因 p53基因等 PCR 快速、靈敏、大規(guī)模檢測(cè)37P