膜片鉗技術(shù)在中藥對心肌鈣離子通道作用研究中的應(yīng)用

1、膜片鉗技術(shù)在中藥對心肌鈣離子通道作用研究中的應(yīng)用【摘要】膜片鉗技術(shù)自創(chuàng)造以來，被廣泛用于生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)等多種學(xué)科的根底研究和應(yīng)用研究中，為解決生物學(xué)跨膜信號傳導(dǎo)問題提供了革命性的檢測手段。目前該技術(shù)已運用于中藥對離子通道作用的研究中，尤其是心肌鈣離子通道。本文綜述了近年來中藥對心肌鈣通道的作用?！娟P(guān)鍵詞】膜片鉗技術(shù)；中藥；鈣離子通道TheAppliatinfPathlapintheResearhfTraditinalhineseediinenardiauslealiuhannelsKeyrds:pathlap;traditinalhineseediine;aliuhannels膜片鉗技

2、術(shù)是以微弱電流信號測量為根底,利用玻璃微電極與細胞膜封接來測量多種通道電流,其測量值可到達皮安級(pA,10-12A),是一種典型的低噪聲的測量技術(shù)。膜片鉗技術(shù)的問世給細胞生物學(xué)的研究帶來了一場革命。當(dāng)前該技術(shù)已經(jīng)成為細胞電生理學(xué)的重要研究方法。尤其是該技術(shù)近年來浸透到中醫(yī)藥研究的各個領(lǐng)域,對中醫(yī)藥研究程度的進步起到了很大的推動作用。1膜片鉗技術(shù)的根本原理膜片鉗的根本原理是利用負反響電子線路，將微電極尖端所吸附的一個至幾個平方微米的細胞膜的電位固定在一定程度上，對通過通道的微小離子電流作動態(tài)或靜態(tài)觀察，從而研究其功能。膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)膜電流固定的關(guān)鍵步驟是在玻璃微電極尖端邊緣與細胞膜之間形成高阻

3、密封，其阻抗數(shù)值可達10100G。由于此阻值如此之高，故根本上可看成絕緣，其上之電流可看成零。此密封不僅電學(xué)上近乎絕緣，在機械上也是較結(jié)實的。此時可通過膜片鉗放大器，選用不同的記錄形式細胞吸附式ell-attahed，全細胞形式hel-ell等對細胞進展電壓和電流鉗制，記錄各種離子通道電流、細胞的靜息膜電位及動作電位等。2心肌細胞鈣離子通道1958年Fart和Katz等率先發(fā)現(xiàn)了鈣離子通道(L型鈣通道),目前已證實心肌細胞上存在B型、L型和T型三種鈣通道且后二者屬電壓依賴性通道(Vltagedependenthannels,VDs)。B型鈣通道即背景鈣通道(bakgrunda2hannels)

4、，是靜息鈣通道；L型(lng-lasting)鈣通道是細胞興奮過程中鈣離子內(nèi)流的主要途徑；T型transient鈣通道的功能與維持細胞自律性和低膜電位(接近靜息膜電位)時鈣的跨膜運動有關(guān)。心肌細胞上的L型鈣通道，其啟閉對動作電位平臺期的形成、細胞內(nèi)鈣離子增高以及心肌細胞的電生理特性等起重要作用。3部分中藥對心肌鈣離子通道的作用目前膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用主要在以下幾個方面：離子通道特性的研究；離子通道活動調(diào)控的研究；離子通道生理與病理情況下作用機制的研究；單細胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究；藥物作用機制的研究。對中藥研究而言，現(xiàn)階段主要使用膜片鉗單通道或者全細胞技術(shù)，觀察中藥對離子通道特性的影響來解釋藥物作用

5、的機理，這將有利于說明中藥在細胞程度的作用機制。我們通過中藥提取物對心肌各種鈣通道的影響研究，來討論其防治心率失常、強心的作用機制，或者發(fā)現(xiàn)其引起心率失常的離子通道原因。3.1人參現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)人參根中含有多種人參皂甙。包括齊墩果酸型人參皂甙單體R0，人參二醇組皂甙R,Rd，人參皂甙Rg1，人參三醇組皂甙單體Rh等。齊墩果酸型人參皂甙單體R0(200l/l)對心肌L、B、T型3種類型鈣通道的活動均無影響1。但是人參皂甙Rg1、人參二醇組皂甙R,Rd1500g/l、人參三醇組皂甙單體Rh160l/L可使心肌鈣通道的平均開放時間縮短,平均關(guān)閉時間延長,開放概率減小，但對3種類型鈣通道的電流幅值無明顯

6、影響,其作用與異搏定相似,與BayK8644相反24。通過與鈣通道阻滯劑異搏定37.5g/l、鈣通道沖動劑BAYK8644(5nl/L)的對照實驗,證明人參二醇組皂甙R200g/l對鈣通道有阻滯作用而Rd200g/l那么無此作用5。3.2粉防己堿粉防己堿是從防己科多年生木質(zhì)藤本植物粉防己中提取的。運用膜片鉗單通道技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)0.3300l/L粉防己堿濃度依賴性地阻滯L型鈣電流,半數(shù)抑制濃度I50為13.3l/L，但對其電流-電壓曲線無明顯影響6。全細胞記錄研究7卻發(fā)現(xiàn)1l/L粉防已堿可使電流-電壓曲線的各電流值均降低，0.13.2l/L使鈣電流呈濃度依賴性降低,I50為0.7l/L。此外,0.

7、3l/L就能阻滯異丙腎上腺素0.1l/L引起的鈣電流增大。雖然兩者在實驗詳細結(jié)果上有差異，但仍證明粉防己堿可阻滯心肌細胞L型鈣電流。3.3丹參丹參為活血化瘀的代表藥之一，除含脂溶性非醌類成分，丹參酮、丹參酮-A等外，還有水溶性成分。全細胞記錄實驗說明,丹參酮-A10、20和40l/L可使L型鈣電流的峰值分別減少35.2%、57.7%和74.7%,但對最大激活鈣電流的電壓依賴曲線及穩(wěn)定激活曲線無影響8，9。同樣使用全細胞記錄，經(jīng)過20in的缺氧以及5in的復(fù)氧后,50、100、200g/L丹參分別將兔心室肌細胞L型鈣通道電流的峰值從(667.9158.7)pA減小至(537.1121.3)pA、

8、(497.247.9)pA、(343.873.1)pA10，11。顯然,丹參酮-A具有類似異搏停樣L型鈣通道阻斷劑作用,其阻斷作用呈非電壓依賴性；丹參能有效地減少缺氧復(fù)氧后心室肌細胞的L型鈣電流,這種作用可能是其抗心肌缺血以及抗缺血再灌性心律失常的機制之一。3.4三七皂甙通過全細胞膜片鉗技術(shù)觀察：三七皂甙Rb110l/L和30l/L分別使BayK8644和nifedipine敏感的鈣內(nèi)向電流即L型鈣電流減少16.2%3.7%和38.3%10.4%,且在3-1000l/L范圍內(nèi),其抑制作用呈濃度依賴關(guān)系；同劑量的三七皂甙Rg1對該電流無明顯影響1213；三七總皂甙100g/L和300g/L對大鼠

9、心肌細胞L型鈣電流的抑制率分別為(26.734.5)%和(4919.6)%14。因此可以認(rèn)為三七總皂甙、Rb1為L型鈣通道阻滯劑而Rg1對其無抑制作用。3.5黃芪研究發(fā)現(xiàn)黃芪對L型鈣電流有雙向調(diào)節(jié)作用。它一般不影響正常心肌細胞L型鈣電流的幅度,但可抑制病毒感染細胞L型鈣電流的增加,從而防止病毒感染可能導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈣超載,對感染細胞起到保護作用15。這可能是黃芪用于心肌炎治療的作用機制之一。另一方面，黃芪還具有恢復(fù)受抑制的L型鈣電流的作用。急性心肌梗死1周時，兔梗死周邊區(qū)心室肌細胞L型鈣電流受到抑制,電流-電壓關(guān)系曲線(I-V)上移,失活曲線左移,半數(shù)最大失活電位由-13.14.2V左移至-25

10、.97.0V,失活速度加快16。這可能是急性心梗后室性心律失常發(fā)生的原因之一。使用黃芪后，缺血引起的L型鈣電流的抑制有部分改善。3.6其他中藥對心肌鈣離子通道作用的研究川芎嗪、丹皮酚、芍藥苷、青藤堿28阻斷L型鈣電流，但不使I-V曲線的峰值發(fā)生偏移。其中丹皮酚、青藤堿可使I-V曲線上移，這些可部分解釋其抗心律失常作用機制。芍藥苷激活曲線沒有明顯的改變，失活曲線向較負電壓的方向偏移,通道從失活中恢復(fù)的時間明顯延長。蓮心堿29阻斷L型鈣電流后使峰電位略右移，而烏頭堿30、大豆皂甙單體AI31雖然能顯著阻斷L型鈣通道的活動,使其開放時間縮短、關(guān)閉時間延長、開放概率下降但對通道的電流幅度無明顯影響。4

11、討論和展望綜上所述，中藥對心肌細胞鈣通道作用的研究不僅品種繁多，而且方法多樣，既有膜片鉗單通道記錄，也有全細胞記錄。上述大部分中藥具有類似鈣拮抗劑的作用，也有少部分類似鈣沖動劑，例如黃連素、異馬錢子堿等。所以上世紀(jì)80年代，陳可冀教授率先提出關(guān)于中藥鈣拮抗劑的研究方向。這可看成是鈣通道藥理學(xué)在我國開展的一個特殊分支學(xué)科。目前對中藥影響心肌細胞鈣通道作用的研究雖多，但是仍存在不少問題。首先，盡管研究已經(jīng)深化到中藥的有效成分，但對中藥復(fù)方研究的文獻尚少。而中醫(yī)治療以復(fù)方為主，復(fù)方研究盡管復(fù)雜，但意義重大，需要引起重視。其次，對通道的研究尚處在初層次。文獻結(jié)果多以開放時間、開放概率、電流幅度、I-V

12、曲線的變化等參數(shù)為主。往往滿足于觀察到對通道表現(xiàn)出抑制或者激活這一現(xiàn)象，而沒有進一步分析通道抑制或者激活的原因。我們知道通道的開放受氧化復(fù)原反響、磷酸化或去磷酸化反響、以及蛋白激酶等等因素調(diào)控，外界刺激可以直接作用于通道產(chǎn)生作用，或者通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑間接作用于通道。我們施加的中藥到底是直接還是間接作用于通道，這就需要單通道膜片鉗記錄和全細胞記錄結(jié)合起來一起研究，兩者的結(jié)果互相參考。假如某種中藥施加到浴液中，對通道只有直接作用而無間接作用，理論上電流只出如今全細胞記錄，而不出如今單通道記錄。而我們目前的研究多只是使用一種膜片鉗的記錄形式。假如是間接作用于通道，那它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游和下游途徑又是如何的。這些問題都需要我們做進一步的研究。因此，我們應(yīng)該把膜片鉗技術(shù)和PR技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)結(jié)合起來，對通道進展研究。用膜片鉗技術(shù)研究了單個細胞的通道電學(xué)特性后，使用PR技術(shù)對該細胞內(nèi)這種通道亞基RNA的表達情況進展分析。細胞內(nèi)的RNA程度變化常常反映蛋白產(chǎn)物的變化，