基因敲除知識(shí)補(bǔ)充

1、7.19同源臂通常是指打靶載體上待插入的外源序列兩側(cè)的與基因組序列完全一致的側(cè)翼序列，用于識(shí)別并發(fā)生重組的區(qū)域同源序列是指在同一物種不同個(gè)體間或不同物種間相同或相似的DNA序列臂的結(jié)構(gòu)，所謂臂，指的是手臂樣結(jié)構(gòu)。而同源臂是指一段同源序列，類似于tRNA氨基酸同源重組設(shè)計(jì)上游臂W下游臂的長(zhǎng)度多長(zhǎng)合適?uy6211I瀏覽佃96次陽分享丨2003-06-0606:55我有更好的普案V2條回答按默認(rèn)排序i按時(shí)間排序智慧-AngelI三級(jí)2015-05-3021:07般300-800bp比較合適，但根據(jù)不同的物種會(huì)有差異評(píng)論Liuy621I級(jí)最快回答2000-06-0816:57般來說同源重組左右同源臂

2、的總長(zhǎng)比所缺失基因大1KE評(píng)論IT載體的定義：T載體(T-Vector)是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TA克隆)的專用質(zhì)粒載體，為線性化載體，無需酶切可直接與具有A末端的PCR產(chǎn)物連接，屬于非定向克隆。T載體的作用原理:T7TranscriptionStart大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都具有在PCR產(chǎn)物的3末端添加一個(gè)“A”的特性（下圖紅色框內(nèi)所示位置）。因此,人們?cè)诰€性化平末端載體的兩端分別又人工加上一個(gè)額外的T堿基（下圖兩個(gè)紅色箭頭所示），從而可與PCR克隆產(chǎn)物的A末端互補(bǔ)配對(duì)，提高了PCR產(chǎn)物連接和克隆的效率。GCATGCTCCCGGCCGCGTACGAGGGCCGGC5TGT

3、AATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTC3r.ACATTATGCTGAGTGATATCCCGCTTAACCCGGGCTGCAGT7PromoterApalAatllSphlBstZICCATGGCCGCGGGATT3GGTACCGGCGCCCTANcolSac11f.1AFCACTAGTG(conedInserKttagtgatcacAI_llSpefIIHII1NetsPstlSallNdefCGGCCGCCGGGCCTGCAGGTCGACCATATGCGGACGTCCAGCTGGTATACBstZISP6TranscriptionStartGGAGACCT

4、CTGCTCCCAACGCGAGGGTTGCIISacICGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGGCAACCTACGTATCGMCTCATAAGATATCII_NsilTGTCACCTAAAT.r3fACAGTGGA7TTA.5TBstXISP6PromoterT載體進(jìn)行TA克隆的優(yōu)勢(shì):相對(duì)于另一種非定向克隆平末端克隆，使用T載體進(jìn)行TA克隆是一種快速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾證明，平末端克隆的連接效率僅為粘端連接的1/50，且自身環(huán)化率高。T載體的制備：商業(yè)化T載體：一般來說，商業(yè)化的T載體多是先使用平端限制性內(nèi)切酶（如EcoRV）將克隆載體進(jìn)行線性化，然后

5、再單獨(dú)加入dTTP和Taq酶7275C反應(yīng)，進(jìn)行末端的加T。1自制T載體：一種常見的自制方法是利用限制性內(nèi)切酶制造出具有單個(gè)T末端突出的片段，最常用的內(nèi)切酶為XcmI2，其識(shí)別和切割特點(diǎn)如下：5.l.CCANNNNN，NNNNTGG.J.33.1GGTNNNN1NNNNNACCr-5P其中XcmI的識(shí)別序列分別為兩端的CCA和TGG，而切割序列則為中間三角箭頭所指的N（N代表任意堿基）。由于N可以是任意堿基，所以如果將切割位置的N設(shè)置為T,那么在該酶的切割下，就可以產(chǎn)生一個(gè)3T末端。相似的，在其互補(bǔ)鏈上設(shè)置另一個(gè)相同或者類似的XcmI酶切位點(diǎn)（保證切割位點(diǎn)為T即可）就可以產(chǎn)生另一個(gè)T末端。一般

6、可以在商業(yè)化的T載體基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，通過PCR或者合成Oligo的方式插入上述兩個(gè)XcmI位點(diǎn)。連接成功的質(zhì)粒可按需要自行擴(kuò)增和保存，使用時(shí)用XcmI進(jìn)行完全酶切（這里的酶切必須保證完全，否則載體易自連，所以XcmI酶最好過量，或者適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），就可以制備得到T載體。3常見T載體及序列：雖然上面提到可以自制T-Vector,但實(shí)際上現(xiàn)在的商業(yè)化載體已經(jīng)做到比較便宜，而且批次間穩(wěn)定性保持的不錯(cuò)。最常見的T-Vector要屬Takara公司的pMD系列（pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T以及對(duì)應(yīng)的去除多克隆酶切位點(diǎn)的Simple載體，如pMD19-T-Simple4）和Prome

7、ga公司的pGEM系列（pGEM-T和pGEM-TEasy）5。載體:zaiti英文單詞vector，在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和細(xì)菌病毒和動(dòng)植物病毒。運(yùn)載體在基因操作過程中使用運(yùn)載體有兩個(gè)目的：一是用它作為運(yùn)載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中去；二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量的復(fù)制（稱為克?。，F(xiàn)在所用的運(yùn)載體主要有兩類：一類是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒，它是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小、獨(dú)立于染色體DNA之外的環(huán)狀DNA（一般有1200kb左右，kb為千堿基對(duì)），有的一個(gè)細(xì)菌中有一個(gè)，有的一個(gè)細(xì)菌

8、中有多個(gè)。質(zhì)粒能通過細(xì)菌間的接合由一個(gè)細(xì)菌向另一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移，可以獨(dú)立復(fù)制，也可整合到細(xì)菌染色體DNA中，隨著染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制。另一類運(yùn)載體是噬菌體或某些病毒等。現(xiàn)在人們還在不斷尋找新的運(yùn)載體，如葉綠體或線粒體DNA等也有可能成為運(yùn)載體。作為運(yùn)載體必須具有四個(gè)條件：在宿主細(xì)胞中能保存下來并能大量復(fù)制；有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)最好只有一個(gè)，如大腸桿菌PBR322就有多種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，可適于多種限制酶切割的DNA插入；含有復(fù)制起始位點(diǎn)，能夠獨(dú)立復(fù)制；有一定的標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。如大腸桿菌的PBR322質(zhì)粒攜帶氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，就可以作為篩選的標(biāo)記基因。

9、一般來說，天然運(yùn)載體往往不能滿足上述要求，因此需要根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)運(yùn)載體進(jìn)行人工改建?，F(xiàn)在所使用的質(zhì)粒載體幾乎都是經(jīng)過改建的。基因克隆的載體類型：質(zhì)粒載體，噬菌體載體，柯斯質(zhì)粒載體，M13噬菌體載體，噬菌粒載體t載體就是一種常用的克隆載體，既然是克隆載體當(dāng)然是用來克隆目的基因片段的TaqDNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與t載體末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。關(guān)于菌株的幾個(gè)概念：野生型菌株：從自然界分離到的微生物在其發(fā)生突變前的原始狀態(tài)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過人工誘變或自然突變失去合成某種營(yíng)養(yǎng)的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因

10、子才能生長(zhǎng)。原養(yǎng)型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營(yíng)養(yǎng)要求在表型上和野生型相同關(guān)于培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（minimalmedium，MM）：僅能滿足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，用-來表示。完全培養(yǎng)基（completemedium，CM）：凡可滿一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌營(yíng)養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。用+來表示。補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementalmedium，SM）：凡只能滿相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)需要的組全培養(yǎng)基，它是在基本培養(yǎng)基中加入該菌株不能合成的營(yíng)養(yǎng)因子而組成。營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指缺乏合成某種對(duì)自身生長(zhǎng)繁殖所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸、維生素、堿基等）的能力的突變型，只能從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基

11、中獲得這些物質(zhì)或其前體物才能正常生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出是通過一系列培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)的。基本培養(yǎng)基（MM）能滿足野生型和原養(yǎng)型菌株最低營(yíng)養(yǎng)要求的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)要求的天然培養(yǎng)或半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）在MM中有針對(duì)地補(bǔ)加某一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分，以滿足特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)要求的培養(yǎng)基誘變后的菌體經(jīng)富集培養(yǎng)后，涂布于CM平板上,將長(zhǎng)出的菌落按一定排列次序逐個(gè)地點(diǎn)種MM平板、CM平板的相應(yīng)位置。培養(yǎng)后，在CM上有菌落生長(zhǎng)而iMM的相應(yīng)位置上沒有生長(zhǎng)的菌落J能是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。挑取菌體分別接種而M、CM上進(jìn)一步復(fù)證除點(diǎn)植對(duì)照法外，還可通過影印法、夾層法、限量補(bǔ)給法

12、等檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型?？截悢?shù)就是指某基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù).單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個(gè)，多則指有多個(gè)。實(shí)驗(yàn)材料人腸桿茵K12的野生型茵株大腸桿茵實(shí)驗(yàn)器貝和藥品用具：滅茵培薦皿（9cm）,滅茵二角瓶（150inlh滅茵離心管。培薦基1）肉湯液休培養(yǎng)基:牛I対膏o.5g,蛋F脅lg.NaClO5g,蒸惘水100ml,Ph7.2,高壓滅菌2磅/英寸*15分鐘a2）肉湯液體培養(yǎng)基（巫：牛I対膏0一陽蛋白跌1印NaClO5g,蒸餡水50ml,Ph7.2,高壓滅茵鍋15磅/英、315分鐘.3）基本液體培養(yǎng)基：葡萄糖2莖僻水98nil,pH7.0,高壓滅茵呂磅/英30分忡4）

13、基本固體培養(yǎng)基：瓊脂甚本液體培養(yǎng)基lOOniLpH7.0,高樂滅茵&磅/英T230分鐘。分無N基本液體培養(yǎng)基：K2HPO40.7g,KH2PO403gl檸檬酸鈉-3H.O0.5g,MgSO47H2OO.Olg,葡體糖2g,蒸餡水lOOinl,P117.0,高壓滅茵8磅/英5230分鐘.6）2N基本液體培養(yǎng)基:KcHPCMUg.KHiPOWdg,檸檬酸抽弓0.5g,MgSO4*7H2O0.01g（NH4）2SO40.2gt葡萄糖2g,蒸憎水1OOnil.P117.0-高樂滅茵&磅，莢-30分鐘。=理鹽水：NaC10S5g,蒸憎水100ml,高圧滅茵15磅/英215分鐘匚2-1-1菌種人腸桿茵(E

14、.coli)K12菌株2,1.2培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基X4(10rrl/100ml酵母膏5g/L.蛋白10g/L.NaCI10g/L.議帽水lOOmk卩H7.2：LB固體培養(yǎng)基Xl(240/500ml)：酵母膏5g/L、蛋白陳10g/L.NaCI10g/L、蒸餡水lOOmk瓊脂2.0%,pH7.2；2XLB液體培養(yǎng)基Xl(3ml/試管)；酵母膏10g/L.蛋白陳20e/L、NaCI20g/L.蒸懈水50mkpH7.2；無氮基本培養(yǎng)基Xl(5m|/100ml)：K2HPO47g/L,KH2PO43g/L擰檬酸鈉*3H2O5g/L,MgS04*7H200.1g/L.葡萄糖20g/IL,蒸鎘水100m

15、l,pH7.0,2N基本液體培養(yǎng)基Xl(5ml/100ml)：K2HPO47g/L.KH2PO43g/L,檸檬酸鈉*3HQ5g/L.MgSO4*7H2O0.1g/L.葡萄糖20g/IL,(NH4)2SO42g/L,蒸館f水1OOmLpH7.D；基本固休培養(yǎng)基Xl(300/500ml：50XVogel*2mR葡薊糖20g/L、蒸惆水98mk瓊脂2.0%.pH7.0o2.1.3試劑0.85%生理鹽水,混合氨基酸和混合維生素(見表一)四、材料(一)菌種E.coli(二)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)液(Luria-Bertani培養(yǎng)基這個(gè)名字來源于英語的lysogenybroth,即溶菌肉湯。是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常

16、用的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大腸桿菌等細(xì)菌，分為液態(tài)培養(yǎng)基和加入瓊脂制成的固態(tài)培養(yǎng)基。加入抗生素的LB培養(yǎng)基可用于篩選以大腸桿菌為宿主的克隆。)：酵母膏，0.5g；蛋白胨，lg；NaCI,0.5g；水，100ml,pH7.2121C滅菌15min2XLB培養(yǎng)液：其它不變，水，50ml?；九囵B(yǎng)基：葡萄糖0.5g，(NH4)2SO40.1g，檸檬酸鈉0.1g，MgSO47H2O0.02g，K2HPO40.4g，KH2PO40.6g,重蒸水100mL，pH7.2，110C滅菌20min。配固體培養(yǎng)基時(shí)需加2%洗滌處理過的瓊脂。全部藥品需用分析純，使用的器皿需用蒸餾水或重蒸水沖洗23次。無N基本液體培養(yǎng)基：

17、K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g;檸檬酸鈉3H2O,0.5g；MgSO47H20,0.01g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0110C滅菌20min2N基本培養(yǎng)基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g;檸檬酸鈉3H2O,0.5g；MgSO47H20,0.01g;(NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0110C滅菌20min完全培養(yǎng)基同LB培養(yǎng)基，配置固體培養(yǎng)基，需加2%的瓊脂?；旌习被岷突旌暇S生素表2人腸桿菌K12中與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TMS:跨膜片段)Table2Thesecondaryactivetransporter

18、involvedinaminoacidtransportinEscliericliiacoliK12(IMS：traiisnieinbranesegments)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白勢(shì)能離子轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸吸收/分泌共轉(zhuǎn)運(yùn)方向TMS與無機(jī)陽離子（Na+/F）同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AGCS家族（丙氨酸/甘氨酸:Na+/H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC2.A.25）YaaJ(l)0007),Na+、ll+丙氨酸吸收同向9APC超家族（氨基酸-多胺-有機(jī)金屬陽離子超家族TC2.A.3）AroP(l)0112),9Na+、芳香族氨基酸吸收同向12CycA(1)4208)20Na+、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸吸收同向12LysP(b2156)N

19、a+、賴氨酸吸收同向12PlieP(l)0576)22Na+、苯丙氨酸吸收同向12ProY(1)0402)t,Na+、ll+脯氨酸吸收同向12MnmP(1)0260)2Na+、S-甲基-甲硫氨酸吸收同向12YeeF(l)2014)23Na+、脯氨酸吸收同向12YI)aT(1)0486)Na+、絲氨酸？?12YcaM(1)0899)Na+、氨基酸？?13AnsP(bl453)Na+、天冬氨酸?12YcjJ(l)1296)Na+、ll+賴氨酸？?12DAACS家族（二竣酸鹽/氨基酸：陽離子（Na+或HJ同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC2.A.23）GltP(l)4077)24Na+谷氨酸吸收同向1()SstT(l

20、)3089)25Na+絲氨酸、蘇氨酸吸收同向8ESS家族（谷氨酸：N才同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC2.A.27）GltS(1)3653)26Na+谷氨酸吸收同向9I1AAAF家族【2（輕基/芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC2.A.42）Mlr(b3161)ir色氨酸吸收同向11TnaB(1)3709)ir色氨酸吸收同向11TyrP(1)1907)ir酷氨酸吸收同向11S(laC(1)2796)ir絲氨酸吸收同向11T(lcC(l)3116)ii+蘇氨酸吸收同向11LIVCS家族（支鏈氨基酸：陽離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC2.A.26）BrnQ(1)0401)27a,、H支璉氮基酸吸收冋向12MFS超家族冋（主要易化子超家

21、族TC2.A.1）Pn)P(l)4111)Na+、脯氨酸吸收同向12YlijE(l)3523)Na+、脯氨酸吸收同向11YdfJ(l)1543)Na+、ll+脯氨酸吸收同向9SSS家族（溶質(zhì)：Na+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2.A.21）PutP(l)1015)29Na+脯氨酸吸收同向12TRAP-T家族（組分ATP-不依賴型周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TC2.A.56）YiaM(1)3577)YiaN(l)3578)Yia()(1)3579)Na+谷氨酸吸收同向41()0與其它離子同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LysE家族（L-賴氨酸分泌蛋白TC2.A.75）YggA(l)2923)3OOH-賴氨酸、精氨酸分泌同向6與無機(jī)陽離子（Na7H0反向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT超家族叫藥物/代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族TC2.A.7）Y(1(1G(I)1473)11+芳香族氨基酸分泌反向1()YdeD(bl533)11+半胱氨酸分泌反向1()RlitA(l)()813)11+蘇氨酸、高絲氨酸分泌反向1()LIV-E家族（