植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)

1、 植物組織培養(yǎng)的 理論基礎(chǔ) 第一節(jié) 植物細胞的全能性一、細胞全能性的概念 任何具有完整的細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必需的全部遺傳信息，即細胞具有全能性。 細胞全能性概念隨著實踐的發(fā)展逐步完善。 1934年，White首次定義為: 每個植物活細胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。 20世紀70年代，擴大了以上定義范圍，為：植物活細胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。 目前細胞全能性定義為：每個植物活細胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。 應(yīng)激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)的特征。 生物體的生

2、存離不開環(huán)境條件，而環(huán)境又是不斷變化的。除四季有規(guī)律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災(zāi)、高溫、低溫、昆蟲侵害等等。 生物體具有“某種機制”來感知和正確估計環(huán)境的變化，以便在體內(nèi)加以校正，保證體內(nèi)平衡，來應(yīng)付突變的環(huán)境。如有植物種子休眠期很長，可以避開旱、澇、冷、熱等惡劣環(huán)境（如：500年前蓮子發(fā)芽,沙漠綠洲）。有的植物對蟲蛀有應(yīng)激反應(yīng)，蟲蛀后，非但不減產(chǎn)，甚至還能增產(chǎn)。變色龍的變色、壁虎的尾巴等等。 自我復(fù)制： 是指生物體利用自身作模板，通過代謝作用，復(fù)制出完全相同的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生也具有相同的自體繁殖能力的突變結(jié)構(gòu)。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。 “遺傳”保證了物種的純化，“變異”為物種

3、的進化提供依據(jù)。 自我復(fù)制實現(xiàn)了遺傳與變異的矛盾統(tǒng)一。 自我復(fù)制方式因繁殖方式不同而不同。無性繁殖植物通過體細胞分裂即可實現(xiàn)自我復(fù)制。 有性繁殖植物自我復(fù)制必須通過配子體世代和孢子體世代，即： 受精卵 組織分化、器官形成 性成熟 配子 合子（受精卵）減數(shù)分裂細胞分裂精子卵子 二、離體培養(yǎng)細胞展現(xiàn)該物種的生 命特性（一）培養(yǎng)細胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠色細胞具有光自養(yǎng)能力；固氮植物細胞具有固氮特性；培養(yǎng)細胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。（二）應(yīng)激性 在適宜培養(yǎng)條件下，離體細胞具有應(yīng)激性，表現(xiàn)在： 非綠色細胞應(yīng)變出對培養(yǎng)和環(huán)境的對應(yīng)方式，以異養(yǎng)

4、方式生存并發(fā)展。依靠培養(yǎng)基供給營養(yǎng)來生存。 植物組織切割損傷后，應(yīng)激于培養(yǎng)條件而出現(xiàn)脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。（三）培養(yǎng)細胞展現(xiàn)自體復(fù)制特性 脫分化 植物組織 愈傷組織 （脫分化細胞） 再分化 植株 脫分化 細胞、原生質(zhì)體 再分化愈傷組織 植株 細胞分裂 原生質(zhì)體融合愈傷組織 再分化 植株以上實例證明： 細胞分裂以及植株再生展現(xiàn)了培養(yǎng)細胞自體復(fù)制的特征屬性。 第二節(jié) 脫分化與再分化 脫分化：具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細胞轉(zhuǎn)化成沒有特異結(jié)構(gòu)和功能的細胞的過程稱為脫分化。（如根、莖、葉） 再分化：是指離體培養(yǎng)物可以由脫分化狀態(tài)再度分化。包括細胞分化、組織分化和器官分化遞進地進行，最后再生

5、完整植株。一、外植體脫分化 如莖段、根段、葉柄段、葉片、花藥、花粉、幼胚等。（一）誘導期間的細胞生物學變化 植物組織從母體上切割下來后，會發(fā)生一系列細胞學及生物化學方面的變化。 1）細胞結(jié)構(gòu)變化：細胞核形狀及外表變化，染色體的凝集，線粒體外形及數(shù)量改變等等。 2）代謝及生化變化：氣體交換率增加，核糖體出現(xiàn)，有關(guān)酶的增加等。（二）與脫分化有關(guān)的因子及其作用 任何具有完整的細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必需的全部遺傳信息，即細胞具有全能性。這種植物所具有的全能性只是一種可能性。細胞全能性所需要的條件：離體損傷刺激；營養(yǎng)物質(zhì)及激素的刺激；培養(yǎng)溫度、光照等的影響。 離體損傷刺激 要使植物組

6、織或細胞經(jīng)脫分化再生植株，必須從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，即處于離體條件 (正常植株葉片上不會再長植株或愈傷組織)。離體損傷刺激是細胞脫分化的重要條件之一。 損傷刺激會使細胞呼吸速度增大，稱為“損傷呼吸”，酶的活性增加，代謝物含量變化。生長物質(zhì)的影響 細胞離體后，以異養(yǎng)方式生存，所以必須給與營養(yǎng)物質(zhì)（培養(yǎng)基）。另外，還必須給與激素刺激，以打破抑制力，恢復(fù)細胞分裂。 抑制假說：認為靜止細胞仍然保存著在分生組織狀態(tài)時的那種細胞分裂潛能，只不過存在一種抑制物質(zhì)或抑制力，使細胞分裂能力不能表現(xiàn)。如果去除這種抑制，細胞就恢復(fù)到分裂狀態(tài)。 這種抑制劑的作用原理及作用位點尚不清楚，但其抑制效能可

7、能會在生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（激素）的作用下而失掉，從而使細胞恢復(fù)分裂能力，實現(xiàn)脫分化。 不同植物細胞內(nèi)，抑制劑的質(zhì)和量可能是不同的。因此，在組織培養(yǎng)中，往往因植物不同，培養(yǎng)基中添加激素的種類和濃度以及配比也不同。培養(yǎng)細胞的異質(zhì)性 在組織培養(yǎng)中，往往某一部分細胞能脫分化，而其它細胞則不能，表現(xiàn)為異質(zhì)性。光照和溫度的影響 各種植物對光照和溫度的要求不同。 有的植物需要在黑暗條件下誘導愈傷組織；但也有的植物在光照條件下誘導愈傷組織，其植株再生率更高。 對溫度的要求，往往耐高溫植物或起源熱帶植物，所需培養(yǎng)溫度較高（如甘薯）；而耐低溫植物，培養(yǎng)溫度較低。一般植物培養(yǎng)溫度在25左右。 二、愈傷組織的生長 經(jīng)脫分化

8、 導致 細胞具備了分裂能力 結(jié)果細胞不斷增殖愈傷組織的生長愈傷組織的生長1 誘導期 外植體細胞進行分裂準備的時期。 外植體細胞外形沒多大變化，但細胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細胞核體積明顯增大。愈傷組織的生長2 分裂期 外植體細胞開始迅速分裂，但外植體中間部分不分裂。 細胞分裂高峰期的標志：細胞體積最小，細胞核和核仁最大，細胞內(nèi)無大液泡，RNA含量最高。愈傷組織的生長3 形成期 指外植體細胞經(jīng)過誘導期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時期。 細胞分裂由原來局限在外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部的較深層局部分裂。 平周分裂（橫向分裂）：使細胞層數(shù)增多，組織加厚。 垂周分裂（徑向分裂）：使同

9、一層細胞數(shù)量增多，使表面積增大。 愈傷組織的生長并非一致進行，待細胞分裂到一定時期，便會停止分裂。但如果把處在旺盛生長且未分化的愈傷組織切成小塊進行繼代培養(yǎng)，可維持其活躍生長。利用此特點，進行繼代培養(yǎng)，可大量增殖。 也有例外，有的情況下，組織細胞經(jīng)脫分化后，不形成愈傷組織，而是從脫分化的細胞上直接再分化器官。優(yōu)良愈傷組織一般應(yīng)具備的條件：1 旺盛的自我增殖能力，以便于用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。2 容易散碎，以便于用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要的時候能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。3 高度的胚性或再分化能力，以便于從這些愈傷組織得到再生植株。4 經(jīng)過長期繼代培養(yǎng)而不喪失

10、胚性，以便于可能對他們進行各種遺傳操作。為達到以上目的，誘導愈傷組織 采取的策略1 選擇合適的基因型和適當?shù)耐庵搀w2 選擇合適的培養(yǎng)基3 采用某些特殊的理化因素改變愈傷組織誘導培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 例子：玉米幼胚愈傷培養(yǎng)，5mg/L硝酸銀，抑制組織內(nèi)乙烯的作用。根據(jù)對一些禾谷類植物體細胞愈傷研究，將愈傷分3個類型：1 結(jié)構(gòu)致密，生長較慢，容易分化成苗，稱為保守分裂型2 結(jié)構(gòu)松脆，生長旺盛，色澤鮮艷，增殖較快，稱為亢進分裂型 3 結(jié)構(gòu)疏松，生長緩慢，色澤暗淡，稱為衰敗型。三、細胞分化和組織分化 （一）細胞分化及其影響因素 細胞分裂分化成什么樣的細胞，是擬分生組織細胞，還是維管組織細胞，或是其它細胞?

11、影響細胞分化的因素： 1.生長調(diào)節(jié)劑（激素）。培養(yǎng)基中添加生長素、細胞分裂素等的種類、濃度及配比。2.培養(yǎng)基種類（營養(yǎng)成分）3.糖類物質(zhì)。例如培養(yǎng)基中添加蔗糖濃度，過低、過高都不利，一般在2.5%3%比較適宜。4. 其它理化因子。如光照時間、光照強度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值等。 （二）組織分化 在細胞分化的基礎(chǔ)上，可以分化出各種各樣的組織。其中，擬分生組織和維管組織是兩種重要的組織。是形成不定芽和不定根的基礎(chǔ)。 擬分生組織：是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類似分生組織的細胞群，它是脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生一系列細胞分裂而產(chǎn)生的一團小型、薄壁、液泡小的細胞組織。也叫做生長中心或分生組織結(jié)節(jié)。 擬分生組織可以從一個

12、細胞或幾個細胞形成，可以起源于愈傷組織的表面，也可以起源于組織內(nèi)部。 在擬分生組織形成的同時或稍后，愈傷組織中會分化出維管組織結(jié)節(jié)。 維管組織結(jié)節(jié)：是指一個區(qū)域的愈傷組織轉(zhuǎn)化為韌皮分子和木質(zhì)分子的混合結(jié)構(gòu)（類似形成層）。 這種形成層狀的細胞向外延伸與擬分生組織連接，形成芽原基或根原基。 四、器官分化和植株形成 脫分化組織（細胞）形成愈傷組織細胞分化組織分化（擬分生 組織和維管組織節(jié)結(jié)）器官分化（芽和根）植株形成 （一）、器官分化 器官分化主要指根和芽的分化。是否能夠發(fā)生器官分化，與前培養(yǎng)有關(guān)，如脫分化、細胞分化、組織分化等。有了前邊這些分化才會有器官分化。影響器官分化的因素：1 培養(yǎng)基中添加激

13、素的種類、濃度及其配比。這是最主要的影響因素。（具體后述）2 培養(yǎng)基中添加其它成分，如水解蛋白、嘌呤類、嘧啶類、氨基酸等。3 物理因素。如培養(yǎng)溫度、光照時間、光照強度等（二）、完整植株的形成植株再生途徑： 器官分化途徑 體胚分化途徑 器官分化途徑： 1 先分化芽，等芽伸長后在其幼莖基部長根，形成完整小植株2 先分化根，再在根上產(chǎn)生不定芽而形成完整植株3 在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后二者的維管組織互相連接，成為小植株。 除上述之外，還有兩種情況，不經(jīng)脫分化而直接長成植株： 直接伸長莖尖培養(yǎng)（較大時）完整植株 發(fā)育幼胚培養(yǎng)（較大時）完整植株五、體細胞胚胎發(fā)生（Somatic embryonenesis） 在組織培養(yǎng)中，起源于一個非合子細胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。 體細胞胚發(fā)生時期單細胞 小細胞團 球形期 魚雷形期 心形期 體細胞胚（Somatic