環(huán)境微生物菌種鑒定

1、企業(yè)生產過程微生物污染控制實例分析-無菌制劑生產過程微生物菌庫的建立和種屬鑒定1一、立項目的二、采樣方案三、試驗材料及儀器設備四、鑒定方法五、鑒定結果六、結果分析七、討論2 （1）為了了解無菌制劑生產過程中微生物污染情況，即微生物種類及分布情況，實現生產環(huán)境微生物、操作過程微生物與藥品中污染微生物的比較和溯源分析，以便達到生產過程微生物實時有效動態(tài)控制目的。從而滿足藥品GMP對無菌制劑生產過程中微生物污染的監(jiān)測和控制要求。 （2）生產企業(yè)也可以利用這些數據，對無菌制劑生產過程進行微生物風險評估。一、立項目的3 1. 采樣區(qū)域的確定 2.采樣對象及方式的確定 3.采樣頻次的確定二、采樣方案4根據

2、車間的面積、房間數，考慮到可能影響到產品質量的關鍵區(qū)域及易于受到微生物污染的關鍵部位的分布，設定了監(jiān)測點及采樣方案。 企業(yè)按照中國新版藥品GMP的要求，將潔凈區(qū)劃分為A級（動態(tài)100級）、B級（靜態(tài)100級）、C級（10000級）、D級（100000級）。微生物采樣點分布圖見圖1和圖2。其中一車間采樣點共39個，二車間采樣點共98個。1. 采樣區(qū)域的確定51. 采樣區(qū)域的確定（一車間）61. 采樣區(qū)域的確定（二車間）7人員：手套印記 表面接觸（頭、胸、 手腕、肘、膝蓋）環(huán)境：沉降菌（ A級、B級、 C級） 浮游菌（A級、B級）2.采樣對象及方式的確定8企業(yè)根據生產情況和制劑車間的使用頻次按季度

3、制定采樣頻次 ，共收集4個季度的樣本。3.采樣頻次的確定9 1樣本來源 2培養(yǎng)基 3儀器設備 4試劑試藥三、試驗材料及儀器設備 10 1樣本來源 無菌制劑一車間和二車間286份樣本 2培養(yǎng)基 胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），批號：1221965，BD公司； 麥康凱瓊脂（Mac），批號：1108423, BD公司； MRS瓊脂，批號：100915，北京陸橋技術有限責任公司 三、試驗材料及儀器設備 11 3儀器設備 全自動微生物生化鑒定儀（Viteck 2 Compact）：法國生物梅里埃公司； 麥氏濁度比濁儀：法國生物梅里埃公司； BX 41 光學成像顯微鏡：日本奧林巴斯公司； 卡瑪薄層色譜成像

4、儀:瑞士CAMAG卡瑪公司。 API RP三、試驗材料及儀器設備 12 4試劑試藥 革蘭氏染色液：青島高科園海博生物科技有限公司； GN鑒定卡、GP鑒定卡、BCL鑒定卡、YST鑒定卡、ANC鑒定卡：法國生物梅里埃公司。 API RP三、試驗材料及儀器設備 13鑒定流程圖 四、鑒定方法14 1.菌種的純化與復壯 采集的微生物可能在物理的、化學的消殺條件下暴露了較長時間，菌株本身可能存在一定的損傷和變異 ，有必要對送檢菌株進行復壯和再次純化。 首選的復壯及純化培養(yǎng)基為胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）;對于革蘭氏陰性菌，在無法與革蘭氏陽性菌區(qū)分的情況下，也會選擇MaC瓊脂作為純化培養(yǎng)基；對于較難培養(yǎng)的

5、菌株，也采用血平板、改良MRS瓊脂等進行純培養(yǎng)。四、鑒定方法15 四、鑒定方法短小芽孢桿菌16溶血葡萄球菌四、鑒定方法17施氏假單胞菌四、鑒定方法182.革蘭氏染色及鏡檢 表皮葡萄球菌四、鑒定方法192.革蘭氏染色及鏡檢緩慢芽孢桿菌四、鑒定方法202.革蘭氏染色及鏡檢施氏假單胞菌四、鑒定方法213.生化鑒定 （1）采用全自動微生物生化鑒定儀（Viteck 2 Compact），根據革蘭染色結果選擇鑒定卡。 （2）將24小時培養(yǎng)物，用0.45%無菌氯化鈉溶液制備一定濁度的菌懸液，將64個生化反應集成到Viteck鑒定卡上，一般2-10小時左右給出鑒定結果 。 （3）結果判斷：相似度96%-99%

6、為極好，95%-92%為較好，91%-89%為好，88%-85%為可以接受，85%以下的相似度為低分辨率的鑒別。對于只鑒定到屬的鑒別，還需根據提示信息進行補充試驗，進一步甄別到種。 四、鑒定方法22（一）人員環(huán)境總體結果一車間：110株 其中：人員67株 環(huán)境43株二車間：182株 其中：人員133株 環(huán)境49株總計：292株，其中陽性球菌109株（37.3%） 陽性芽孢桿菌 114株（39.0%） 陽性無芽孢桿菌 22株（7.5%） 陰性桿菌 39株（13.4%） 2010-122010-12-1五、鑒定結果23(二)不同區(qū)域結果 一車間主要區(qū)域五、鑒定結果分裝灌裝區(qū)（B級）人員環(huán)境金黃色葡

7、萄球菌溶血葡萄球菌頭狀葡萄球菌蠟樣/蕈狀/蘇云金芽孢桿菌泛菌屬少動鞘氨醇單胞菌,短小芽孢桿菌花域芽孢桿菌解淀粉/萎縮/枯草芽孢桿菌緩慢芽孢桿菌解淀粉類芽孢桿菌 變異庫克菌等溶血葡萄球菌腐生葡萄球菌木糖葡萄球菌表皮葡萄球菌人葡萄球菌藤黃微球菌/里拉微球菌蘇云金芽孢桿菌少動鞘氨醇單胞菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌巨大芽孢桿菌等 24(二)不同區(qū)域結果 一車間主要區(qū)域五、鑒定結果調劑區(qū)（C級）人員環(huán)境人葡萄球菌/腐生葡萄球菌溶血葡萄球菌表皮葡萄球菌科氏葡萄球菌科氏亞種苛養(yǎng)顆粒鏈菌/藤黃微球菌/里拉微球菌藤黃微球菌/里拉微球菌施氏假單胞菌缺陷短波單胞菌/泡囊短波單胞菌泛菌屬淺黃假單胞菌馬耳他布魯菌非脫羧勒菌少動鞘

8、氨醇單胞菌/殺鮭氣單胞菌巨大芽孢桿菌鮑曼不動桿菌蠟樣/蕈狀/蘇云金芽孢桿菌解脲棒桿菌克氏庫克菌銚子短小芽孢桿菌 短小芽孢桿菌等短小芽孢桿菌耳炎差異球菌/玫瑰色庫克菌（采樣少） 25(二)不同區(qū)域結果 二車間主要區(qū)域五、鑒定結果調劑區(qū)（B級） 人員 環(huán)境頭狀葡萄球菌藤黃微球菌/里拉微球菌4溶血葡萄球菌腐生葡萄球菌金黃色葡萄球菌/中間葡萄球菌山羊葡萄球菌表皮葡萄球菌3花域芽孢桿7枯草/解淀粉/萎縮芽孢桿菌11巨大芽孢桿菌2堅強芽孢桿菌2腸膜明串珠菌乳脂亞種緩慢芽孢桿菌5枯草/解淀粉/萎縮/花域芽孢桿菌地衣芽孢桿菌波茨坦短小芽孢桿菌玫瑰色庫克菌殺鮭氣單胞菌/奈瑟菌屬西宮皮球菌/坐皮膚球菌少動鞘氨醇單

9、胞菌蠟樣/蕈狀/蘇云金芽孢桿菌枯草芽孢桿菌銚子短小芽孢桿菌等人葡萄球菌沃氏葡萄球菌金黃色葡萄球菌2頭狀葡萄球菌藤黃微球菌/里拉微球菌模仿葡萄糖球菌非脫羧勒菌植生拉烏爾菌克氏庫克菌酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌短小芽孢桿菌地衣芽胞桿菌簡單芽孢桿菌鮑曼不動桿菌乳酸桿菌解淀粉/萎縮/枯草芽孢桿菌巨大芽孢桿菌等 26(二)不同區(qū)域結果 二車間主要區(qū)域五、鑒定結果分裝灌裝區(qū)（B級） 人員 環(huán)境沃氏葡萄球菌金黃色葡萄球菌溶血葡萄球菌2藤黃微球菌/里拉微球菌8魯氏不動桿菌/少動鞘氨醇單胞菌/殺鮭氣單胞菌枯草芽孢桿菌2枯草/解淀粉/萎縮芽孢桿菌2花域芽孢桿菌地衣芽孢桿菌施氏假單胞菌短小芽孢桿菌4緩慢芽孢桿菌2蠟樣/蘇云金

10、/蕈狀芽孢桿菌巨大芽孢桿菌等藤黃微球菌/里拉微球菌魯氏不動桿菌銅綠假單胞菌蠟樣/蘇云金/蕈狀芽孢桿菌2波茨坦芽孢桿菌枯草芽孢桿菌史密氏芽孢桿菌緩慢芽孢桿菌等 27（三）不同季節(jié)鑒定結果第一季度： 本季度陽性芽孢桿菌的檢出率最高，達到了44.9%；陽性球菌的檢出率居第2位為43.5%，陽性桿菌的檢出率為7.2%，陰性桿菌的檢出率為4.3%。五、鑒定結果28（三）不同季節(jié)鑒定結果第二季度： 在本季度，陽性芽孢桿菌的種群占據絕對優(yōu)勢地位，為54.2%；陽性球菌的檢出率為33.6%；陽性無芽孢桿菌和陰性桿菌的檢出率均為5.6%。五、鑒定結果29（三）不同季節(jié)鑒定結果第三季度： 在本季度，陽性球菌的檢出

11、率為38.3%，陰性桿菌檢出率為31.7%，陽性芽孢桿菌檢出率為16.7%， 陽性無芽孢桿菌檢出率為6.7%。五、鑒定結果30（三）不同季節(jié)鑒定結果第四季度： 本季度陽性球菌的檢出率為35.7%，陰性桿菌的檢出率為21.4%，陽性芽孢桿菌的檢出率為26.8%，陽性無芽孢桿菌的檢出率為12.5%。 五、鑒定結果3132食品微生物方法標準331、生產過程微生物污染結果分析 通過以上樣本鑒定結果，可以看出，生產過程微生物污染主要來源于人員及人員不當的操作過程。環(huán)境的微生物種類與人員表面微生物種類基本一致，主要是革蘭陽性的葡萄球菌屬和革蘭陽性的芽孢桿菌。六、結果分析342.不同季節(jié)微生物污染趨勢變化一

12、車間：從2010年第3季度到2011年第2季度，一車間革蘭氏陽性球菌檢出率始終維持在40%50%的區(qū)間范圍內；革蘭氏陽性無芽孢桿菌檢出率在10%上下徘徊；放線菌、霉菌、酵母菌僅在2010年第3季度零星檢出；革蘭氏陽性芽孢桿菌呈現逐步上升的趨勢；革蘭氏陰性桿菌呈現逐步下降的趨勢。六、結果分析352.不同季節(jié)微生物污染趨勢變化二車間：從2010年第4季度到2011年第2季度，二車間革蘭氏陽性球菌檢出率在30%50%的區(qū)間范圍內；革蘭氏陽性無芽孢桿菌檢出率在10%上下徘徊；放線菌在2010年第4季度和2011年第2季度零星檢出；革蘭氏陽性芽孢桿菌呈現逐步上升的趨勢；革蘭氏陰性桿菌呈現逐步下降的趨勢。

13、 六、結果分析362.不同季節(jié)微生物污染趨勢變化1）在第一、二季度，陽性芽孢桿菌的種群優(yōu)勢明顯。 原因分析：北方的第一、二季度由于天氣寒冷干燥，一些在夏秋容易滋生的微生物，如革蘭氏陰性細菌、霉菌和酵母菌的營養(yǎng)體在空氣中明顯減少，而芽孢桿菌的休眠體（芽孢）則相對增多；另一方面，冬春兩季北方的大氣質量較差，空氣中懸浮的塵埃粒子較多，芽孢可以隨塵埃遷入潔凈區(qū)甚至空調凈化設備中，并長期駐留。2）四個季節(jié)陽性球菌的種群和所占比例基本一致。 提示：陽性球菌的種群受季節(jié)性因素影響較小。六、結果分析372.不同季節(jié)環(huán)境微生物鑒定結果分析 ：3）在第三季度（夏季），陰性桿菌的檢出率較高，陽性芽孢桿菌的檢出率為四

14、個季度中的最低。 提示：夏季優(yōu)勢菌群為陽性球菌和陰性桿菌。六、結果分析381.主要微生物污染源 通過上述分析，296株菌中有200株來自于人員表面接觸皿，可見得無菌制劑生產過程微生物最大的污染源就是人，人員的數量和活動將直接影響著整個潔凈區(qū)的環(huán)境質量。提示要嚴格控制操作人員的衛(wèi)生狀況和無菌操作技術。2.根據微生物分布情況，制定合理的控制措施 通過上述分析，根據不同季節(jié)的生產過程微生物的主要種群分布趨勢，選擇適宜的消殺方法和適當的控制措施，達到更好控制人員和生產環(huán)境的目的。七、討論393.方法尚存在問題，有待進一步改進 本次考察是對無菌制劑生產過程微生物污染情況的初步探索研究，主要采用法國生物梅里埃全自動微生物生化