三種酶活性測定

1、水體中堿性磷酸酶活性：對硝基苯磷酸二鈉（pNpP, sigma公司），本實驗 中所選擇的反應(yīng)條件為:pH8.4（用Tris緩沖溶液調(diào)）、溫度30C、反應(yīng)物體積5mL、 反應(yīng)時間6h、波長4l0nm，島津uv-2401分光光度計測定.A總的0.45um膜藻類0.2um細菌溶解性的物質(zhì)6.Berman T Alkaline phosphatases and phosphorus availabilityin Lake Kinneret 19707.洪華生海水中堿性磷酸酶活力的測定及其在磷循環(huán)中的作用初探 1992(04)8.12.Chrost R J.Overback J. Kinetics of

2、 alkaline phosphataseacitivity and phosphorus availability for phytoplankton andbacterioplankton in lake Plu 8 see (North German Eutrophiclake) 1987(13)底泥中堿性磷酸酶（APA）M定方法AP（磷酸酶）催化無色底物0.1 %-對硝基苯磷酸二鈉（p-NPP）產(chǎn)生穩(wěn)定的 黃色產(chǎn)物P-NP,在410 nm可見光下，通過測定P-NP的產(chǎn)生速率，即可換算出AP 活性APA.1.試劑NaOH: 4g NaOH 溶于 100mL H2O 中對硝基苯磷酸二鈉（p

3、-NPP） : 6.75gp-NPP溶于水中，并稀釋至1000ml.（1ml含 25mg 酚）底物混合液：1ml p-NPP百倍母液+99ml tris-HClTris-HCl緩沖溶液：1g Tris中加入2.061ml濃HCl,用水定容至1000mL，溶液 的pH為8.5對硝基苯酚儲備液（1g/L）：1g對硝基苯酚溶于蒸餾水中并稀釋至1000ml，溶液保存在暗色瓶中.標(biāo)線制備（辛承友2004）對硝基苯酚使用液（10mg/L即1ml含10ug酚）：10ml對硝基苯酚儲備液用緩沖 液稀釋定容到1000ml容量瓶中分別取0,1,2,3,4,5ml對硝基苯酚使用液于10ml EP管內(nèi)，分別加緩沖液

4、5,4,3,2,1,0ml（對硝基苯酚濃度分別為 0,2,4,6,8,10mg/L）加入 0.5ml NaOH離心 5000 轉(zhuǎn),10min離心后取上清，以水為參比,410nm比色實驗組向 EP 管內(nèi)加入 0.1g sediment （2ml water）加底物混合液5ml30oC 6h（搖床上振蕩恒溫培養(yǎng)）加 NaOH 0.5ml,離心 5000 轉(zhuǎn),10min以水為參比,410nm測吸光度對照組向 EP 管內(nèi)加入 0.1g sediment加NaOH 0.5ml，加底物混合液5ml30oC 6h（搖床上振蕩恒溫培養(yǎng)）離心 5000 轉(zhuǎn)，10min以水為參比,410nm測吸光度對照組和實驗組

5、同時進行，標(biāo)線制備一次即可底泥或水樣零下20度保存底泥中脫氫酶(DHA)測定采用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)為基質(zhì)經(jīng)脫 氫酶催化還原反應(yīng)后生成紅色產(chǎn)物(TTCH2-trifenylformazane，TpF)，丙酮萃取。采用分光光 度計于485nm波長處測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)線計算出TpF生成量來表示DHA。依次加人Tris-HCl緩沖溶液1.5 mL、0.l mol/L葡萄糖溶液、0.4 % TTC溶液和0.36 % Na2SO3溶液各0.5 mL,置于37 C恒 溫水浴振蕩儀中培養(yǎng)2 h后取出，加人0.

6、5 mL甲醛終止反應(yīng)，準(zhǔn)確加人5 mL丙酮，37 C振蕩萃取10 min,在3000 r/min的條 件下離心5 min，492 nm處測定吸光度。在上述條件下，l h產(chǎn)生1 散F的量為一個酶活力單位。底泥預(yù)處理：取底泥0.2g sediment于EP管中，用蒸餾水振蕩混合后，5000 r/min離心5 min，棄去上清液，如上方法洗滌三次1.試劑0.36%硫酸鈉溶液：0.36g硫酸鈉用水定容至1000mlTF儲備液：稱取30mgTF用定溶于50mL棕色容量瓶中，此溶液即為l g/L TF 的標(biāo)準(zhǔn)溶液Tris-HCl 緩沖液(pH = 8.4)： 稱取 6.037g Tris，加入 20mL

7、1mol/L HCl,再定容 至 1000mL甲醛丙酮0.4%TTC溶液：取0.4gTTC溶于Tris-HCl緩沖液定容至1000mL，貯存于棕色瓶底物混合液 TTC: Tris-HCL=1:3標(biāo)線制備(周春生1996)TF儲備液：稱取50mgTF定溶于50mL茶色容量瓶中，此溶液即為l g/L TF 的標(biāo)準(zhǔn)溶液.TF梯度溶液：分別吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7mlTF標(biāo)準(zhǔn)儲備液，定容至 5ml，即配成濃度分別為 0、20、40、60、80、100、120、140 g/mL TF 系列溶 液.繪制TF濃度對應(yīng)吸光值的曲線.實驗組0.2g sediment +4m

8、l底物混合液+1ml硫酸鈉+1ml水37oC 2h (搖床振蕩培養(yǎng))2ml甲醛離心 5000r/min，5min 棄上清，加丙酮5ml(丙酮揮發(fā)，加蓋處理)37 oC振蕩萃取10min離心5min取上清485nm比色對照組0.2g sediment +4ml底物混合液+1ml硫酸鈉+1ml水2ml甲醛37oC 2h (搖床振蕩培養(yǎng))離心5000g 5min棄上清加丙酮5ml(丙酮揮發(fā)，加蓋處理)37 oC振蕩萃取10minG-離心 5min (5000r/min)，取上清 485nm 比色對照組和實驗組同時進行，標(biāo)線制備一次即可底泥中脲酶（Urease）測定試劑配制水本實驗均指無氨蒸餾水，蒸餾

9、水煮沸ih即可納氏試劑測定氨氮含量，詳見水樣氨氮分析方法檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）： 184克檸檬酸和147.5克氫氧化鉀溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋至1000毫升。10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml。底物混合液尿素溶液:緩沖液=1:21.標(biāo)線制備吸取0,0.05,0.1,0.3,0.5,0.7,0.9和1mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)液（10mg/l）于EP管中，分別加水5,4.85,4.9,4.7,4.5,4.3,4.1,4ml加0.1ml酒石酸鉀溶液，混勻.加0.15ml納氏試劑,混勻.靜置5min，在波長410nm處測定吸光度.2實驗組0.2 g sediment +4 ml底物混合液（尿素）37oC 24 h加 0.5ml NaOH離心 5000r/min, 10 min取上清3 ml至一新EP管，加水2ml加0.1mL酒石酸鉀鈉溶液，混勻,加0.15 ml納氏試劑，混勻靜置5 min后,410 nm處測定