RNAi實驗4個要素和基本實驗路線

1、RNAi實驗4個要素和基本實驗路線RNA干擾是一種自然發(fā)生的基因沉默機制，應用于基因功能研究和臨床疾病治療，就成為一種功能非常強大的工具。不過，開展RNAi實驗并不難，不需要特殊的儀器，RNAi實驗所需的4大要素一點不復雜：對應目標基因的dsRNA(siRNA,長dsRNA,shRNA載體，看實驗需要)；適合的轉染或者其他將dsRNA遞送進入細胞的方法；適當?shù)膶φ眨粰z測目標基因表達情況的方法%蠢吋SRI4AvectorDicer寸siRFIAssiRFIAsassociate11曲hRISClllllLLLLLmLlHIimmMIJJIllJOTsiRMA1.對應目標基因的dsRNA在非哺乳動

2、物細胞中，直接向細胞導入長雙鏈RNA(dsRNA),在細胞質核酸酶Dicer的作用下可將長雙鏈RNA降解為21-23bp的小分子干擾RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs),這些小分子RNAs結合其他元件形成“RNA誘導沉默復合物”(RNA-inducedsilencingcomplexes，RISCs),并引導RISCs結合到與之互補的mRNA序列上，降解對應的mRNA,從而導致對應蛋白質水平下降,最終導致目標基因表達沉默(見下圖：線路1藍色)。對于哺乳動物細胞來說，導入30bp以上的長雙鏈RNA（dsRNA）往往會誘發(fā)非預期的抗病毒應答反應，此路不通。所以常見的做法

3、是直接制備19-23bp左右的siRNAs,將siRNAs轉入哺乳動物細胞（線路2，紅色）；或者是將短發(fā)夾結構RNA（shorthairpinRNAs，shRNAs）的DNA表達載體轉入細胞，表達產(chǎn)生shRNA，經(jīng)過Dicer切割后得到siRNA（線路3，黃色）；最后siRNAs同樣和其他元件組合成為RNA誘導的沉默復合物RISCs，在siRNA指引下識別對應的mRNA序列并降解mRNA,從而使特定基因表達沉默。線路1和2均為誘發(fā)瞬時基因沉默，持續(xù)時間約37天，根據(jù)目標基因而異，shRNA表達載體則可以建立長效基因沉默的細胞株，進行功能缺失基因組篩選研究，也可用于體內RNAi研究。市面上提供R

4、NAi試劑的廠家越來越多，產(chǎn)品也格外豐富，如何選擇呢？生物通參照這3條主要的RNAi實驗線路的每個步驟，分別匯集介紹市售好用的相關產(chǎn)品，方便大家實驗時作為選擇的參考。2.適合的將dsRNA遞送進入細胞的方法一旦拿到siRNAs或者dsRNA，還需要一種將雙鏈RNA傳遞到細胞里的方法。傳遞的方法因細胞種類不同而異。對于線蟲之類的低等動物活體進行體內RNAi實驗，多見以喂飼或者浸泡方法將dsRNA導入體內。體外培養(yǎng)細胞，多數(shù)的貼壁細胞可以用脂質體或者多胺類試劑來進行有效的轉染；對于原代細胞或者懸浮細胞，如果常規(guī)轉染方法不行，可以用電轉，甚至顯微注射等，或者通過病毒載體感染等方法進行，病毒載體還可以

5、作為哺乳動物體內RNAi實驗的手段。3設置適當?shù)膮⒄丈锿≧NAi實驗特別ebioTipsI：設置好參照：適當?shù)膮⒄諏τ诿總€實驗來說都是關鍵的，必須的，非常重要的。RNAi實驗也不例外。缺少適當?shù)膮⒄?，RNAi實驗的結果就無從分析。未轉染細胞對照：不加轉染試劑的空白對照，用于排除轉染試劑對細胞活力的影響（這個可以在摸轉染條件時先做）空白對照：只加轉染試劑（如果實驗用到載體則可做一組空載體對照），用于排除siRNA轉染對細胞活力的影響負對照：設置不針對目標細胞內源任何基因的siRNA對照，用以排除轉染siRNA對基因表達可能造成的任何非特異影響。正對照：設置針對易于檢測的參照基因的siRNAs，

6、用于確證siRNAs的遞送、轉染以及反應條件環(huán)境是可行的。也有建議選擇和目標基因同一信號通路的另一個基因作為參照，便于排除脫靶等副反應，以及進一步確認目標基因的功能。好的實驗設計應該選擇至少2個以上針對同一目標基因的有效siRNAs同時平行做實驗，以相互驗證實驗結果確實是由于目標基因沉默而引起的，并非個別siRNA的特異現(xiàn)象?？蛇x：熒光標記的siRNAs對照便于檢測siRNA遞送效果4.檢測目標基因表達情況的方法RNAi實驗使得特定細胞中的目標基因在mRNA水平上降解從而導致表達沉默，相當于暫時“敲除”目標基因，通過研究目標基因缺失的情況下細胞發(fā)生的變化，因而得以研究目標基因在細胞中的功能。目

7、標基因不同，可以采用的檢測目標基因表達狀況的方法也千差萬別。在各種檢測方法之前，你首先要確認目標基因的mRNA確實被siRNA介導降解了。由于siRNA作用在mRNA水平上，所以最常用的檢測方法之一是通過實時定量qRT-PCR來檢測目標基因的mRNA水平，比較實驗組和負對照組（用非特異的參照siRNA平行實驗）的差別。生物通ebioTips2:在做實時熒光定量RT-PCR實驗時注意選擇Primer針對的區(qū)域是siRNA對應的同一區(qū)域，以免存在不同的mRNA剪接形式影響對結果的判斷。通常Taqman探針法優(yōu)于SYBRGreen法，因為TaqMan探針法可以檢測同一樣本中2個以上不同的mRNA水平

8、，便于在檢測目標基因的同時檢測參照。由于蛋白質才是最終行使功能的載體，除了在mRNA水平上檢測目標基因的mRNA是否下降，嚴謹?shù)难芯咳藛T還會在蛋白表達水平上檢測目標基因表達產(chǎn)物水平的下降幅度，也就是基因“沉默”的程度。WesternBlot，免疫熒光等方法都是常用的方法。siRNA/dsRNA遞送到細胞內后，應該什么時候做qRT-PCR檢測，什么時候做蛋白檢測呢？轉染8-48小時后就可以檢測到mRNA水平的逐步下降，轉染48小時后檢測mRNA含量通常會得到相對漂亮的結果；48-72小時后可以檢測到蛋白質表達的下降。因為siRNAs的沉默效果是有時效性的，探討最佳的基因沉默效果落在哪個時間點上，

9、就需要多個時間點進行檢測，可以得到siRNA的量、mRNA的量、蛋白的量之間的關系，需要花費更多的功夫。瞬時RNAi而誘導的基因沉默通常可延續(xù)37天，視目標蛋白在生命中的周期而不同。而shRNA表達載體則可以借助選擇壓力或者整合等方式，長時間持續(xù)沉默目標基因的表達。確認目標基因沉默，產(chǎn)物表達下降后，在此基礎上研究人員就可以分析目標基因沉默對細胞功能和形態(tài)的影響，從而研究基因的功能。如果是已知基因，可以用相應的功能檢測試劑盒進行定量檢測。除了嚴謹全面的對照體系，特別嚴謹?shù)膶嶒炦€會設計Rescue實驗來排除假陽性：目標基因mRNA序列對應siRNA的位置引入點突變（不影響產(chǎn)物表達），使得siRNA不能作用于這種外源設計的mRNA，并引入RNAi實驗中看是否能回復由RNAi引起的變化。過表達目標基因、dominantnegativeexpression，或者刺激同一信號通路下游以觀察是否能回復RNAi引起的變化，都有助于驗證RNAi實驗的嚴謹性。不過這些方法如何調節(jié)調控以免引起新的問題，還有待研究。,由于不斷有文章指出高濃度的siRNA（超過100nM）容易引發(fā)抗病毒相應，除了需要摸索條件選擇siRNA最低的有效用量來避免非預期反應，嚴謹?shù)膶嶒炞詈媚軝z測細胞體