浸礦微生物選育及鑒定

1、.：.；標(biāo)題：浸礦微生物的選育及鑒定浸礦微生物的選育及鑒定摘要本綜述結(jié)合當(dāng)今生物冶金的研討現(xiàn)狀，引見了國內(nèi)外浸礦微生物的選育方法，及運(yùn)用各種技術(shù)對(duì)各種浸礦微生物進(jìn)展鑒定和群落構(gòu)造分析，這些方法的運(yùn)用對(duì)生物冶金領(lǐng)域的研討及消費(fèi)實(shí)際具有重要意義。關(guān)鍵詞：浸礦微生物 選育 鑒定 隨著我國礦產(chǎn)資源的不斷開發(fā)利用，富礦資源日趨貧乏，以貧、細(xì)、雜為突出特點(diǎn)的難選冶礦石，所占比例不斷上升，致使常規(guī)的選冶方法，在技術(shù)和經(jīng)濟(jì)兩方面都面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。對(duì)于銅、金、鈾等金屬需求量的不斷添加以及本錢的節(jié)約化，促使冶金技術(shù)的不斷提高，由此產(chǎn)生了生物冶金技術(shù)。生物冶金技術(shù)具有工藝簡單、流程短、配備簡單、投資小、本錢低、污染

2、輕、資源耗費(fèi)量小以及可以理低檔次礦等諸多優(yōu)點(diǎn)，適宜社會(huì)可繼續(xù)開展的要求，因此，生物冶金技術(shù)的開發(fā)研討，己經(jīng)成為礦產(chǎn)資源利用領(lǐng)域的前沿研討課題。隨著生物冶金技術(shù)研討的不斷深化，學(xué)者對(duì)在生物浸礦體系中起關(guān)鍵作用的浸礦微生物的研討越來越多。本文將對(duì)浸礦微生物的選育和鑒定技術(shù)進(jìn)展綜述，為浸礦微生物的研討提供一定的參考，以便能更好的利用生物冶金技術(shù)。1 浸礦微生物浸礦微生物是可以直接或間接地參與金屬硫化礦或氧化物的氧化和溶解過程的微生物。細(xì)菌對(duì)礦物分別的作用主要來源于：1)微生物代謝的分泌物對(duì)目的礦物的選擇性吸附、中和、氧化復(fù)原等作用；2)微生物選擇性地將目的礦物成分吸收進(jìn)入代謝環(huán)節(jié)，然后以另外一種形狀

3、或價(jià)態(tài)將礦物成分釋放于環(huán)境中；3)微生物本身對(duì)目的礦物的選擇性吸附、中和等作用；4)微生物分泌物及代謝過程對(duì)目的礦物復(fù)雜的吸附、氧化復(fù)原等物化作用。根據(jù)溫度范圍，在生物冶金過程中起作用的浸礦菌主要可分為以下3類：(1)嗜中溫細(xì)菌(Mesophile)。最正確生長溫度3045 ，主要包括Thiobadllus ferrooxidans，Thiobadllas thiooxidans，Leptospirillum ferrooxidans。(2)中等嗜熱細(xì)菌(Moderate thermophile)。最正確生長溫度45 55 ，主要有Sulfobacillus菌屬；已鑒定的有Acidimicro

4、bium ferrooxidans，Sulfobacillus thermosulfidooxidans，Sulfobacillus acidophilus。(3)高溫嗜熱菌(Extreme thermophile)。最正確生長溫度60 85 ，包括Sulfolobus：60 70 ；Sulfolobus likearchaea：65 85C。其中，嗜中溫菌和中等嗜熱菌已勝利運(yùn)用于硫化礦的生物氧化中，在低于45 時(shí)以嗜中溫菌為主；在45 60 范圍內(nèi)，以中等嗜熱細(xì)菌為主；在40 45 的范圍內(nèi)能夠有些重疊。高溫嗜熱細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)展了擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)，但還未進(jìn)展大規(guī)模的工業(yè)運(yùn)用。2. 浸礦微生物選育的

5、意義與方法21 選育的意義菌種選育包括選種和育種。選種即根據(jù)微生物的特性，運(yùn)用各種挑選方法從自然界和消費(fèi)中選擇需求的菌種；育種即進(jìn)一步提高已有菌種的某種性能，使其更符合需求，普統(tǒng)統(tǒng)過誘變和雜交來實(shí)現(xiàn)。變異菌株中通常只需少數(shù)在某些性能方面比初始菌株有所提高，育種任務(wù)中也存在選種問題，選出的新菌種有待經(jīng)過育種過程提高其性能，選種與育種有嚴(yán)密聯(lián)絡(luò)。目前，微生物冶金中的硬件設(shè)備和工藝流程曾經(jīng)比較成熟，但浸礦微生物生長速度慢，只需大腸桿菌的萬分之一，且在實(shí)踐浸礦體系中，外表活性劑、重金屬離子、鹵素離子等含量超越一定濃度時(shí)，將抑制細(xì)菌生長，甚至呵斥菌體死亡。因此，要想充分發(fā)揚(yáng)微生物浸礦方法的優(yōu)勢(shì)，提高其礦

6、物浸出效果，除了進(jìn)一步改良工藝外，更重要的是要加強(qiáng)高效菌株的選育任務(wù)，改良菌種以獲得能適用多種礦石、順應(yīng)才干強(qiáng)、氧化活性高并能大規(guī)模運(yùn)用的高效工程菌。2.2 選育方法2.2.1 馴化育種與其它生物相比，微生物對(duì)環(huán)境有很強(qiáng)的順應(yīng)才干。微生物的生長是其與外界環(huán)境相互作用的結(jié)果，在逐漸順應(yīng)環(huán)境的變化過程中基因會(huì)發(fā)生突變，在適宜生長發(fā)育的新環(huán)境下成為優(yōu)勢(shì)種 馴化按目的不同可分為活性和抗性馴化，方法是運(yùn)用目的礦物不斷轉(zhuǎn)代培育或添加有毒離子的轉(zhuǎn)代培育。劉亞潔等報(bào)道鐵一硫氧化細(xì)菌經(jīng)過較高濃度含氟離子培育基長時(shí)間培育馴化后，挑選到的菌株可在含氟148 gL的溶浸液中一晝夜即可將5 gL Fe完全氧化。當(dāng)前大多

7、數(shù)細(xì)菌堆浸場(chǎng)所用菌種為馴化菌種，如張衛(wèi)民等報(bào)道了 永平銅礦浸礦細(xì)菌經(jīng)過4次馴化后，溶液中Fe2+ 的轉(zhuǎn)化速率明顯提高，F(xiàn)e的沉淀率明顯減少，而pH逐漸下降。浸礦細(xì)菌對(duì)金屬離子的抗性主要由質(zhì)?；蚓幋a。目前質(zhì)?？剐詸C(jī)理研討還不夠深化。而張東晨等 對(duì)質(zhì)粒在硫桿菌中普遍存在的觀念提出了質(zhì)疑，研討結(jié)果闡明， 氧化亞鐵硫桿菌對(duì)Fe 、S等的氧化才干能夠只是與擬核染色體DNA有關(guān)，而其遺傳物質(zhì)就是擬核染色體DNA。誘變育種誘變育種是利用物理或化學(xué)的要素(如紫外線、亞硝基胍、微波等誘變劑)處置微生物群體，促使少數(shù)個(gè)體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(主要是DNA)的分子構(gòu)造發(fā)生改動(dòng)，使基因內(nèi)部的堿基配對(duì)發(fā)生過失，從而引起微生

8、物的遺傳性狀發(fā)生突變。根據(jù)運(yùn)用的要求，可以從突變株中挑選出某些具有優(yōu)良性狀的菌株供科研和消費(fèi)運(yùn)用。目前這方面的報(bào)道較多，采用的誘變手段各異，均獲得較好效果。如徐曉軍等報(bào)道了 經(jīng)紫外線誘變的浸礦細(xì)菌對(duì)黃銅礦的浸出率比原始菌提高了46 以上，到達(dá)浸出終點(diǎn)的時(shí)間也縮短了5lO天。蔣金龍等用亞硝基胍(NTG)對(duì)氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)展誘變育種，發(fā)現(xiàn)誘變后菌株的氧化活性在原先的根底上提高了4倍。熊英等報(bào)道經(jīng)馴化后的氧化亞鐵硫桿菌用紫外線、微波作為誘變劑進(jìn)展復(fù)合處置誘變選育Tf菌的氧化活性由末被馴化、誘變前的007 g(I h)提高到318 g (I h)。誘變育種所獲得的優(yōu)良菌株要運(yùn)用到工業(yè)實(shí)踐中去，必需是遺

9、傳穩(wěn)定的突變菌株，亦即在菌種保管和運(yùn)用過程中其突變或抵抗基因突變的頻率要很小，這就要求在育種過程中作一段長期的培育和觀測(cè)，反復(fù)傳代觀測(cè)其性狀穩(wěn)定性； 當(dāng)培育穩(wěn)定時(shí)，還要對(duì)保管的菌種作一定時(shí)期的復(fù)活培育，分別其未回復(fù)突變株、淘汰其同復(fù)突變株，并確定適當(dāng)?shù)谋９芊椒ê蜁r(shí)期。2.2.3 接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)過供體菌和受體菌完好細(xì)胞間的直接接觸而傳送大段DNA的過程稱為接合，也稱細(xì)菌“雜交。革蘭氏陰性細(xì)菌最為常見。有接協(xié)作用的細(xì)菌是有性別分化的，與一種F質(zhì)粒有關(guān)，根據(jù)F質(zhì)粒的有無和存在方式可分為4種類型： F (雄性)菌株；F-(雌性)菌株；Hfr(高頻重組)菌株；F菌株。F質(zhì)粒的切割與整合可在群體間傳送

10、基因，產(chǎn)生新的遺傳類型。受體菌直接吸收供體菌的DNA 片段，然后同源配對(duì)交換，從而獲得供體菌的部分遺傳性狀的景象稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌稱轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化與親緣關(guān)系和感受態(tài)的建立有關(guān)。經(jīng)過缺陷噬菌體的媒介，將供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得了前者部分遺傳性狀的景象稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)是由于噬菌體的錯(cuò)誤包裝發(fā)生的。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的受體菌叫轉(zhuǎn)導(dǎo)子。2.2.4 細(xì)胞交融經(jīng)過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生交融，并產(chǎn)生重組子的過程稱為細(xì)胞交融。細(xì)胞交融在革蘭氏陽性菌中比較容易，在革蘭氏陰性菌中勝利的例子不多。其原理和主要過程是兩個(gè)有選擇性遺傳標(biāo)志的突變體，在高滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿?

11、如細(xì)菌可用溶菌酶或青霉素處置)除去細(xì)胞壁，再將構(gòu)成的原生質(zhì)體離心聚集，并參與促交融劑PEG(聚乙二醇)促進(jìn)交融，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細(xì)胞壁或進(jìn)展分裂的培育基上，待構(gòu)成菌體后，經(jīng)過影印接種法，將其接種到各種選擇性培育基上，最后鑒定它們?yōu)橹亟M子。2.2.5 基因工程育種基因工程育種足指利用基因工程方法對(duì)消費(fèi)菌株進(jìn)展改造而獲得高產(chǎn) 程菌，或是經(jīng)過微生物間的轉(zhuǎn)基因此獲得新菌種的育種方法。來源不同的氧化亞鐵硫桿蔭菌株對(duì)金屬硫化礦物的浸出效果是不一樣的，闡明氧化 鐵硫桿菌具有復(fù)雜的遺傳特性。貝雷A D、漢斯福德G s對(duì)兩株氧化亞鐵硫桿菌的染色體基因組大小進(jìn)展r研討，發(fā)現(xiàn)其大小為29 Mb左

12、右 。據(jù)報(bào)道，在氧化亞鐵硫桿菌的ghnS基因的C端發(fā)現(xiàn)了一個(gè)代號(hào)為Tn5468的轉(zhuǎn)座子，其序列與Tn7類似。在來源于 同地點(diǎn)的茼株染色體上存在兩種2O3O個(gè)拷貝的反復(fù)序列，IST1和IST2能存染色體DNA 中挪動(dòng)，使菌落發(fā)生表型轉(zhuǎn)移口 。1994年P(guān)eng等利用大腸桿菌IncP族質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到氧化亞鐵硫桿茼中并表達(dá)其功能的特性，使該質(zhì)粒上的兩個(gè)抗性基因(卡那霉素和鏈霉素基兇)和抗砷基因(Asr)被勝利地轉(zhuǎn)移到氧化亞鐵硫桿菌中。徐海巖等u l利用氧化 鐵硫桿菌抗砷上 菌Tf 59(pSDX3)處置含砷金精礦，獲得了較好的抗砷效果。趙清等經(jīng)過利用DNA體外重組技術(shù)，構(gòu)建了含有強(qiáng)啟動(dòng)子、可在tra基因

13、誘動(dòng)下轉(zhuǎn)移的組成型表達(dá)的抗砷質(zhì)粒pSDRA4。經(jīng)過接合轉(zhuǎn)移的方式將其導(dǎo)入專性自養(yǎng)極端嗜酸性喜溫硫桿菌Acidithiobacillus c II IdW 中，構(gòu)建了冶金工程菌Acidithiobacillus caldus(pSDRA4)，重組質(zhì)粒在喜溫硫桿菌中具有較好的穩(wěn)定性(重組質(zhì)粒保管76%以上，野生菌相比，構(gòu)建的喜溫硫桿菌工程菌抗砷才干明顯提高，從10 mmolL高到45 mmolL.2.3 改良育種需留意的問題在進(jìn)展生物改良育種過程中，為得到高效穩(wěn)定的工業(yè)用菌，就必需用有效的育種程序，適于浸礦菌生長的育種培育基，育種方法的正確選擇以及育種過程中菌株挑選的有效性。(1)有效的育種程序可

14、以在不同誘變處置后，能在后處置中以恰當(dāng)?shù)哪康姆错懗鲎钣行У恼蛔兙?，以此菌株再培育、富集、自然淘汰出?fù)變菌株，選擇出最好的正突變菌株，運(yùn)用于工業(yè)實(shí)踐中去。(2)微生物的分別純化和菌株挑選和微生物的生理生化研討都需求正確的培育基，特別是在育種中所運(yùn)用的固體培育基。常規(guī)瓊脂有機(jī)凝固劑對(duì)自養(yǎng)浸礦菌有抑制造用，不利于菌株挑選。硅膠無機(jī)凝固劑雖無抑制性，但操作性能很差。因此在進(jìn)展改良育種時(shí)，馴化耐受有機(jī)物才干強(qiáng)的混合菌株進(jìn)展定向選育育種；也可比較各種凝固劑的效果，尋覓比較理想的凝固劑；或者將有機(jī)凝固劑的抑制分子進(jìn)展純化處置。(3)針對(duì)菌種改良的誘變或基因工程方法，不同的菌種，選擇正確的方法。誘變主要分

15、為物理誘變和化學(xué)誘變。對(duì)于Tf菌而言，因其在化學(xué)誘變過程中，有機(jī)物對(duì)其生長有劇烈的抑制造用，因此普通采用物理誘變就能得到高效穩(wěn)定的誘變工業(yè)菌種。(4)改良育種所獲得菌株運(yùn)用到工業(yè)實(shí)踐中去，必需是穩(wěn)定的突變菌株。亦即在菌種保管和運(yùn)用過程中其回復(fù)突變或抑制基因突變的頻率要很小，這要求在育種過程需求長期的培育和觀測(cè)，反復(fù)觀測(cè)其性狀穩(wěn)定性。在實(shí)踐菌種改良過程中，亦可從培育環(huán)境，如溫度、pH值、重金屬離子濃度等條件思索，做到快速有效挑選和改良。隨著生物技術(shù)不斷開展和運(yùn)用分子生物學(xué)手段的不斷提高，獲得高效穩(wěn)定的、繁衍速度快、氧化才干強(qiáng)、環(huán)境順應(yīng)才干強(qiáng)的基因工程菌是完全能夠的。3. 浸礦微生物鑒定3.1 常

16、規(guī)方法微生物鑒定的常規(guī)方法，是指經(jīng)過純培育，獲得純菌株后，將測(cè)定的細(xì)胞的形狀學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)的各種目的，與權(quán)威性的菌種鑒定手冊(cè)比較，獲得菌種的分類信息 。早期的鑒定，就是經(jīng)過此方法進(jìn)展的，但是，這種方法需求的時(shí)間長，而且有些浸礦微生物難以獲得純培育。Johnson 曾經(jīng)過平板培育的方式，發(fā)現(xiàn)有機(jī)物對(duì)專性自養(yǎng)菌Acidithiobacillus ferrooxidans有毒害作用，導(dǎo)致它很難在固體瓊脂培育基上生長，但經(jīng)過夾層培育或引入異養(yǎng)菌Acidiphilum，可獲得純的At.ferrooxidans. 由此可以推斷，早期獲得的純的Atferrooxidans，有能夠是Atferrooxid

17、ans和Acidiphilum 的混合菌株。3.2 免疫學(xué)方法3.2.1 免疫熒光法免疫熒光法是一種使結(jié)合有熒光素的抗體與抗原進(jìn)展反響，借以提高免疫反響靈敏度和適宜顯微鏡察看的免疫標(biāo)志技術(shù)。Baker和Mills 將熒光抗體(Fluorescent antibody，F(xiàn)A)和2-(p-Iodopheny1)一3一(pNitropheny1) 一5-Phenyltetrazolium hloride(INT)結(jié)合，此技術(shù)又稱為FAINT。他們利用FAINT技術(shù)研討了酸性和非酸性環(huán)境中Thiobacillus ferrooxidans 的分布。經(jīng)過比較FAINT技術(shù)，熒光抗體染色和MPN (Mos

18、t Probable Number)，結(jié)果闡明，MPN低估活細(xì)胞數(shù)13個(gè)數(shù)量級(jí)，而熒光抗體染色估計(jì)過高。3.2.2 斑點(diǎn)免疫測(cè)定法該方法是Jerez提出來的，可以快速特異性鑒定Tferrooxidans、Lferrooxidans和Thio- bacillus thiooxidans。該方法的根本過程為：首先，將要鑒定的細(xì)菌以硝酸纖維素濾膜過濾，使細(xì)菌呈點(diǎn)狀分布在膜上。然后，用一次抗體和細(xì)胞反響，再與酶結(jié)合的可以和一次抗體特異結(jié)合的二次抗體反響。酶經(jīng)過催化無色底物產(chǎn)生有色底物，斑點(diǎn)中要鑒定細(xì)菌的數(shù)量與有色底物的多少成正比。同時(shí)，做一細(xì)菌數(shù)知的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過計(jì)算機(jī)圖像分析軟件，來確定斑點(diǎn)中細(xì)菌的

19、數(shù)量。該方法可以檢測(cè)的最低限為每個(gè)斑點(diǎn)103細(xì)胞。3.3 分子生物學(xué)方法對(duì)于浸礦微生物的檢測(cè)，免疫學(xué)方法是針對(duì)某一種知菌或多個(gè)菌種的檢測(cè)。但是，隨著人們對(duì)于浸礦微生物的認(rèn)識(shí)逐漸加深，發(fā)現(xiàn)可以浸礦的細(xì)菌種類很多，而且存在一些未知的菌種。因此，針對(duì)單一菌種或者多個(gè)菌種的檢測(cè)，已不能闡明浸礦環(huán)境中的微生物種群的問題，便逐漸開展出了可以檢測(cè)微生物種群的技術(shù)，這也是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的技術(shù)而開展起來的，特別是PCR技術(shù)。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，原有的DNA 可以擴(kuò)增106以上，因此，對(duì)于分析微量且濃度低的樣品特別有效。3.3.1 16S rRNA基因序列分析由于16S rRNA作為原核生物分類的一個(gè)規(guī)范，因此

20、，將16S rRNA基因全長測(cè)序后與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫比較，就可知道原核生物的分類信息。Okibe等 用此方法研討了攪拌罐浸出操作中的微生物群落，共分別到4種菌：Atcaldus、Leptospirillum sp、Sul fobacillus sp和Ferroplasma。這些原核生物的相對(duì)數(shù)量，在三個(gè)采樣的反響器中是變化的。隨著礦物的氧化，F(xiàn)erroplasma成為優(yōu)勢(shì)菌，而且在第三個(gè)反響器中，占到了平板分別的99%上。證明混合鐵氧化菌和硫氧化菌，可加速硫化礦物的氧化，也闡明隨著礦物的溶解，微生物種群也會(huì)隨著改動(dòng)。3.3.2 構(gòu)建克隆文庫克隆文庫的構(gòu)建分為以下幾步：首先提取樣品核酸，PCR擴(kuò)增1

21、6S rRNA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體相連，然后將載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)過固體平板培育的方式，挑選陽性菌落，組成克隆文庫。再提取陽性克隆的質(zhì)粒，測(cè)序后與NCBI中的數(shù)據(jù)庫進(jìn)展比較，就可知道文庫中的菌種及數(shù)量。郝春博經(jīng)過16S rRNA基因文庫的構(gòu)建，對(duì)浸礦微生物生態(tài)學(xué)進(jìn)展研討。闡明某反響器內(nèi)嗜酸菌的組成，主要包括五種嗜酸細(xì)菌Lferriphilum，Acaldus，Sulfobacillus spAlicyclobacillus sp. 和革蘭氏陽性嗜酸鐵氧化菌，其中前三種是穩(wěn)定存在的。3.3.3 PCRSSCP (PCRSingle Stranded Conformation Polymorphi

22、sm)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Stranded Conformation Polymorphism) 的原理，是基于不同單鏈DNA 的不同折疊構(gòu)象會(huì)影響電泳進(jìn)程中的遷移率。經(jīng)過PCR擴(kuò)增出的DNA，經(jīng)變性產(chǎn)生兩條互補(bǔ)的DNA 單鏈， 由于堿基序列及空間構(gòu)象的不同，在非變性聚丙烯酰胺凝膠中呈現(xiàn)不同的帶型。Foucher等 運(yùn)用SSCP研討了含鈷黃鐵礦柱浸和攪拌罐浸出中細(xì)菌種群演化，分別研討了吸附在礦石上以及浸出液中的細(xì)菌組成。浸出液中，在實(shí)驗(yàn)的第一階段，優(yōu)勢(shì)菌為Tcaldus，之后被Lferrooxidans替代。吸附在礦石上的優(yōu)勢(shì)菌一直為是L ferrooxidans。Sulfobaci

23、llus thermosulfidooxidans不是很恒定，似乎在柱浸時(shí)生長更好。3.3.4 PCRDGGE (PCRDenatured Gradient Gel Electrophoresis)變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis) 的根本原理，基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)展到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改動(dòng)時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化過程而被分別。Demergasso等采用DGGE對(duì)智利的一個(gè)低檔次粗制硫化銅礦堆浸中的微生物群落進(jìn)展了一年

24、的監(jiān)測(cè)。第一階段主要是Atferrooxidans和古細(xì)菌Sulfurisphaera。第二階段(從225338天)主要是Leptospirillum 和Ferroplasma 。第三階段(從598到749d)Sulfobacillus成為優(yōu)勢(shì)菌，F(xiàn)erroplasma是獨(dú)一檢測(cè)到的古細(xì)菌。3.3.5熒光原位雜交(Fluorescent In Situ Hybridizatlon， FISH ) FISH技術(shù)的根本原理為：將寡核苷酸探針用熒光染料標(biāo)志，再使之與固定在載玻片上的微生物樣品雜交，將未雜交的熒光探針洗去后，用共聚焦激光掃描顯微鏡或普通熒光顯微鏡進(jìn)展察看和攝像。用這一方法，可以防止細(xì)菌

25、的培育，清楚并方便地察看到樣品中細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)量和空間位置，而且可以利用不同的寡核苷酸探針，同時(shí)對(duì)不同類群的細(xì)菌，在細(xì)胞程度上進(jìn)展原位的定性定量分析和空間位置識(shí)別。Bond等 運(yùn)用FISH 技術(shù)，研討了美國Richmond礦酸性礦山排水中的微生物群落，結(jié)果闡明，在極低的pH值及高離子強(qiáng)度的地方，F(xiàn)erroplasma spp為優(yōu)勢(shì)菌。在許多礦泥中檢測(cè)到Leptospirillum spp， 而Sulfobacillus spp在溫度較高的地方是優(yōu)勢(shì)菌。3.3.6 多種方法組合運(yùn)用為了全面了解微生物群落組成、演替的信息，可將多種方法組合運(yùn)用，這樣可以防止方法本身所帶來的不可防止的偏向。Kinnun

26、en和Puhakkan運(yùn)用FISH 和DGGE，研討了產(chǎn)生Fe抖的流化床反響器中微生物組成，結(jié)果闡明，Lferriphilum為優(yōu)勢(shì)菌，古細(xì)菌Ferroplasma acidiphilum 只需不到1%。結(jié)語結(jié)合菌種選育在生物冶金中的運(yùn)用現(xiàn)狀，今后關(guān)于浸礦微生物菌種的選育可以做以下的研討任務(wù)：理浸礦微生物的誘變育種；生物選育中誘變育種的作用機(jī)理，以便更好地指點(diǎn)誘變操作和消費(fèi)實(shí)際，更好地控制誘變條件；綜合思索菌種的挑選和培育及其它影響要素，取不同的菌株進(jìn)展正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)最優(yōu)控制；礦微生物的分子生物學(xué)領(lǐng)域根底性研討；因工程育種技術(shù)構(gòu)建出能大規(guī)模運(yùn)用于工業(yè)的高效工程菌。浸礦微生物的鑒定，就是要搞清楚

27、浸礦過程中微生物群落的組成以及演替情況。浸礦環(huán)境中的微生物，由于受環(huán)境因子的影響，組成復(fù)雜，有時(shí)存在一些未知的微生物。如今通常采用現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)方法，對(duì)浸礦微生物進(jìn)展鑒定，PCRSSCP 、PCRDGGE和FISH是如今運(yùn)用最廣的三種方法，已勝利運(yùn)用于堆浸、柱浸、攪拌罐浸出中細(xì)菌的鑒定。PCRSSCP和PCRDGGE可以快速檢測(cè)和鑒定環(huán)境中數(shù)量比例大于1 的細(xì)菌，F(xiàn)ISH 雖不能鑒定未知微生物，但可以更加直觀的反映原位的微生物組成分布情況，可對(duì)微生物群落進(jìn)展定量估計(jì)，而多種方法的組合運(yùn)用，可獲得詳細(xì)的微生物的群落構(gòu)造信息。參考文獻(xiàn)1劉亞潔李江等鈾礦石生物浸出中氟對(duì)鐵一硫氧化細(xì)菌的影響J.有色礦冶.2006(2)：18212 張東晨，張明旭等.硫微生物氧化亞鐵硫桿菌遺傳特性的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)J.煤炭學(xué)報(bào)2006(1)：1041073余水靜 郭燕華