楊樹CDPK基因家族的表達分析及功能預測

1、林業(yè)科學研究2021，27(5)：604611Forest Research文章編號：10011498(2021)05-604-08楊樹CDPK基因家族的表達分析 及功能預測張進，李建波，劉伯斌，陳 軍，盧孟柱(林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所北京100091)摘要：為探究CDPK基因在木材形成過程中的作用，本研究在基因組水平上對楊樹CDPKs基因家族的成員進行分 析，找到32個CDPKs及10個CRKs成員。對CDPK基因家族成員在楊樹中表達特性進行了分析，發(fā)現(xiàn)其家族成員 在不同組織、不同發(fā)育階段以及毛白楊次生維管發(fā)育不同時期的表達特性不同。分析楊樹CDPK基因家族中

2、3個 基因PtCPKI、PtCPK6、PtCPKl5，其蛋白質一級結構均存在1個跨膜區(qū)，其蛋白定位在細胞膜上。 關鍵詞：楊樹；CDPK；基因家族；基因表達中圖分類號：S7921I文獻標識碼：AExpression and Functional Analysis of CDPK Gene Family in PopulusZHANG Jin，Jianbo，LIU Bo-bin，CHEN Jun，LU Meng-zhu(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Research Institute of Forestry，Chinese

3、Academy of Fomstry，Beijing100091，China)Abstract：Calciumdependent protein kinases(CDPKs)are important Ca2+sensors and effectors in Ca2+signal transduetion pathwayThey play crucial roles in regulation of plant development and tolerance of various environ mental stressesIn this study，a genome-wide anal

4、ysis of Populus CDPKs was performed，including phylogeny，gene structure and expression patternsThirty-two CDPK genes and ten CRK genes were identifiedFurthermore，the gene expression profiles showed that a number of Populuz CDPK differentially expressed across different tissues anddevelopmental stages

5、Three Populus CDPK gene，iePtCPKl，PtCPK6 and PtCPKl5，were cloned and analyzed，revealing their proteins localized in cell membraneThese results may lay the foundation for functional analysis of Populus CDPK gene family in the futureKey words：Populus；CDPK；gene family；gene expression植物在其生長發(fā)育過程中，會受到各種內外

6、瞬問變化而產生Ca2+信號心。，Ca2+信號能被各 因素的影響，植物體自身形成了一套復雜的信號 種不同的Ca2+傳感器感知并將其傳遞給下游分 網(wǎng)絡途徑來適應多變的外界環(huán)境。Ca2+作為植 子，如下游靶蛋白的磷酸化等卜8i。植物體內存 物中重要的第二信使，在細胞信號轉導過程中起 在4類ca2+傳感蛋I芻Ca“結合蛋白，即鈣調素 重要作用 。在植物中，各種外界刺激，如光照、 (Calmodulin，CaM)、類鈣調素蛋白(Calmodulin 激素、生物脅迫及非生物脅迫都會觸發(fā)Ca2+在胞 1ike proteins，CaML)、鈣調磷酸酶B類似蛋白 內濃度的變化，胞外信號經受體進行一系列跨膜 (

7、Caleineurin B like proteins，CBLsSCaBPs)和鈣依 信號轉換后，調節(jié)Ca2+的分布及其在特定部位的 賴蛋白激酶(Calciumdependent protein kinases，收稿日期：2021-06-20 基金工程：“十二五863方案課題“楊樹分子育種與品種創(chuàng)制(2021AAl00201)；中國博士后科學基金面上資助(2021M550104) 作者簡介：張進(1985一)，男，博士研究生主要研究方向：樹木性狀的分子根底 ：01062824020E-mail：zhang一007jin163COrn通訊 研究員，博士生導師，從事分子生物學研究Email：Lum

8、zcafaccn萬方數(shù)據(jù)第5期張進等：楊樹CDPK基因家族的表達分析及功能預測605CDPKs)一。12|，其中，CaM、CaML和CBL僅包含 楊樹CDPK基因的功能提供了根底。ca2+結合域，缺乏效應域，因此，它們只能作為1 材料與方法ca2+信號感應器，通過與其它靶蛋白的結合來調節(jié)其活性口J。相比之下，CDPK蛋白那么包含1個11實驗材料N-端可變區(qū)及3個功能區(qū)，功能區(qū)分別為具有催 實驗所用楊樹次生維管再生材料取自毛白楊 化活性的SerThr蛋白激酶區(qū)、自抑制區(qū)以及包 (Populus tomentosa Carr)形成層區(qū)域，由中國林業(yè) 含EFhand模塊負責結合ca2+的CaM區(qū)凹1

9、3。 科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室保存。楊 CDPK獨特的結構使它同時具備ca2+感應器和效 樹次生維管再生材料取材方法詳見Du曬J，所用組 應器的功能。CDPK通過解除其自抑制的機制使 織部位為包含未成熟木質部的形成層區(qū)域，毛白橇 其具有活性4|。當Ca2+結合到CDPK的CaM區(qū) 剝皮后第6、10、12、14、16、18和22天的樣本用于基 時，CDPK蛋白構象發(fā)生改變，將自抑制區(qū)從激酶 因表達分析。大腸桿菌(Escherichia coli)菌揀 區(qū)釋放，從而激活其酶活性。近年來，有研究表 TranslT1購自天根生化科技(北京)，根嫡 明，所有C端區(qū)同催化區(qū)一起行使激活 農桿菌

10、(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101由 活性156|。 本實驗室保存。CDPK是植物中研究最為深入的Ca2+傳感器 12實驗試劑 之一，到目前為止，已經在植物界中從綠藻到顯PCR所用試劑和Marker購自天根生化科技有花植物以及原生生物中都發(fā)現(xiàn)了CDPK，但在酵 限公司(北京)。RNA提取和反轉錄試劑盒Super 母、線蟲、果蠅和人中都沒有發(fā)現(xiàn)CDPK的存scriptlII Firststrand Kit等購置于Invitrogen公司(上在1。在各類植物中的大量研究說明，CDPK廣海)。用Primer50軟件設計引物，Realtime PCR所泛參與植物的各

11、種響應，如高光強、激素響應、機用引物使用在線設計軟件Primer3 Input 040(ht 械損傷、非生物脅迫以及病原菌侵染等。水稻中tp：ffodowimiteduprimer3)設計，實驗所需引 OsCDPKl3、OsCDPKl2和OsCDPK21分別在低物均在Invitrogen公司合成。 溫、低氮及鹽脅迫響應過程中起作用n20|。蒺13數(shù)據(jù)來源藜苜蓿(Medicago truncatula)CDPKl參與根系發(fā)擬南芥CDPK基因及其編碼的蛋白質序列來源育，將CDPKl通過RNAi沉默后，導致轉基因植 于TAIR( ：wwwarabidopsisors)數(shù)據(jù)庫。利 株發(fā)根數(shù)量與根細胞長

12、度顯著降低，基因芯片分 用得到的擬南芥蛋白質序列為搜索對象，通過blastp 析說明，CDPKl沉默后改變了細胞壁以及防御相程序在楊樹基因組數(shù)據(jù)庫( ：wwwphytozome 關基因的表達舊。葡萄CPKl在擬南芥中超表 netpoplarphp)中搜索相似的蛋白序列。 達促進了植物生長，增強了萌發(fā)、萌發(fā)后生長和 14系統(tǒng)進化樹分析 氣孔運動中的ABA超敏性悼2|。此外，Ca2+和為評估楊樹和擬南芥CDPK基因的進化關系， CDPK還參與黃瓜中NO和生長素誘導的不定根 利用Clustal X1對其氨基酸序列進行多序列比對， 形成舊3|。這些研究都說明CDPK廣泛參與了植使用MEGA5027 3

13、中的Neighbor-Joining(NJ)法構建 物的各種環(huán)境響應，但其確切的生物學功能目前 系統(tǒng)進化樹。 并不十分清楚。目前，在擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn) 15基因結構分析34個CDPK基因成員舊J，水稻中檢測到31個 楊樹及擬南芥CDPK基因的外顯子及內含子結 CDPK基因成員【24|。楊樹全基因組序列雖已公 構使用GSDS1程序( ：gsdscbi 布，但對于CDPK基因家族成員的研究尚不系 cn)完成，其基因組DNA序列及CDS序列下載自 統(tǒng)。本研究利用擬南芥CDPK蛋白序列，在楊樹 Phytozome數(shù)據(jù)庫( ：wwwphytozomenet)。 基因組數(shù)據(jù)庫中查找相應的同源序列，共檢測

14、到16基因表達分析32個CDPK基因及10個CRK(CDPKRelated Ki- RNA提取方法參照植物總RNA提取試劑盒 nase)基因成員。在此根底上，構建了楊樹CDPK (RNeasy Plant Kit)操作方法，反轉錄為cDNA第1 蛋白的系統(tǒng)進化樹，并對其中3個CDPK蛋白的 鏈，以cDNA為模板進行qRTPCR。引物序列見 亞細胞定位進行了分析。研究結果為以后解析 表1。萬方數(shù)據(jù)林業(yè)科學研究第27卷 表1實驗所用引物序列中28搖培。離心重新懸浮后，用注射器吸取菌引物 引物序列(5 73，液，從下表皮經氣孔將菌液緩緩注射進煙草葉片中。RC糾UF1TGGGC7rrAGGACCGAG

15、TATG培養(yǎng)36 h后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號RC糾日R1TCCCTrCTCACjIC7ICACACP留一F1 GCCGATGGAGGA，rGTAAGAA在煙草表皮細胞內的分布。ACP豳一R1 rCCTCC默AGCTCCCTTCAAPtCP髟箏F1AACAGAATCAGGAATC7ITCAGACAG2 結果與分析RCP搿一Rl GACAATACICAGA A1AAGAGGlIPtC尸_飚5Fl GGAGGAAATrGCTGGT丌GA21楊樹中CDPK基因的發(fā)現(xiàn)及系統(tǒng)進化分析ACP笱R1TCCTCGCGCTCT7兀TGTrPtcP融51AAGCTCTC7rG從GCTGAAGTCAA鈣依

16、賴蛋白激酶(CDPKs，CPKs)是一種鈣依賴ACP腳5一R1 ATACCCACllGCrGTCCltrTCAA的SerThr型蛋白激酶，由多基因編碼，廣泛存在于PtcPK33耳lGGCAATAlTCACGGGAAAGA各種植物中。在楊樹全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索相似的nCP船3一Rl CCCCCATGACAAACAAATrC蛋白質序列，選取E10。10的序列為候選序列，共篩PtcPK36逼、TrIBCACClGAGGATrrrCPtcPK36正uCAGGCAACAGAP,GCATrGAA 選得到32個eD脹基因及10個ce,x(CDPKRelatP蚺c協(xié)F GTGCTTCTAAGTICGAACAG

17、TGCed Kinase)基因。有研究說明，楊樹中的基因數(shù)目大P以ct汛一RGACTACCA從GI伽TGACCACCA約是擬南芥中同源基因的1416倍J。目前，擬南芥中CDPK有34個，而楊樹中CDPK基因Realtime PCR操作參照SYBR(E)Premix ExTaqTM Kit(Perfect Real Time，TaKaRa)進行。每個 數(shù)目僅有32個，并不符合這個比例。推測可能的原樣品設置6個重復，用PtActin作為內參對照。因是一些功能冗余的基因在楊樹基因組復制重組的分析楊樹CDPK基因表達所用的基因芯片數(shù)據(jù)過程中喪失，而30個左右的CDPK足夠使其完成正下載自NCBI Ge

18、ne Expression Omnibus(GEO)舊1數(shù)常的生物學功能。圖1是這些CDPK和CRK在基據(jù)庫。本研究中用到的芯片數(shù)據(jù)序列號分別為因組連鎖群上的物理位置，發(fā)現(xiàn)除了第XIII、XVII和GSEl3043及GSE21481。第XVIII號連鎖群上沒有CDPKs的分布外，其他連鎖群上都有CDPKs的分布。同擬南芥一樣，楊樹17亞細胞定位構建35S啟動子驅動下的PtCPKl一1P、CDPKs分布于4個組中，其中，Group II和Group IIIPtCPK6一YFP及PtCPKl5一YFP融合表達載體。將構又可以分別進一步分為a、b 2個亞組，Group IV中 建完成的質粒轉化農桿菌

19、GV3101后，于LB培養(yǎng)基含有的CDPK數(shù)量最少(圖2)。1圜CPK5UPtCPKl ：9睜cPK27n盯E p恨；PP式PtcPK3藿|藿|藿|P肛瓜簽PPH、PtcP刖。n耵H忙址么W眇一瑚廿m 舭艇E一、圖1楊樹CDPKs基因家族成員的染色體定位(楊樹19條染色體標記為：IXIX)萬方數(shù)據(jù)第5期 張進等：楊樹CDPK基因家族的表達分析及功能預測CPK Group IVPtCPK9CPKCPK GrouP I、分別表示CPK家族的組I、組、組、組 圖2楊樹和擬南芥的CDPK基因進化關系22 CDPK及CRK基因外顯子內含子結構 已公布的楊樹基因芯片數(shù)據(jù)，分析了楊樹CDPKs基 通過對楊樹

20、32個CDPK及10個CRK基因結構因在不同節(jié)間以及不同部位的表達情況。在莖第2 (外顯子內含子)及其與擬南芥的CDPK家族成員 節(jié)間，PtCPK8、PtCPKl3、PtCPK23及PtCPK25表達 的基因結構比擬，內含子數(shù)目分別為6、7、8、10和 較高，說明它們可能在初生莖發(fā)育過程中起主要作11，其中，以含有6個內含子的CDPK基因最多。通 用；而在第5節(jié)問中，許多CDPKs基因表達較高，如 過其基因結構分析，由于染色體復制的存在，該家族 PtCPK7 7 PtCPKl2、PtCPKl4 7 PtCPKl9、PtCPK261中存在一些基因對：Rc腳RCP豳0、PtCPK2 PtCPK30

21、、PtCPK31等，說明這些基因可能參與了從PtCPK20、PtCPKl9PtCPK26、PtCPK6PtCPK5 7 初生莖到次生莖的發(fā)育過程；在莖第9節(jié)間中， PtCPK4PtCPKll、PtCPKl7PtCPK25、PtCPK3 PtCPK7 7 PtCPKl 1、PtCPKl6、PtCPKl9，PtCPK26、 PtCPK22、PtCPK27PtCPK29、PtCPKl5PtCPK21 7 PtCPK27、PtCPK30、PtCRK2、PtCRK3、PtCRK7表達 PtCPK7PtCPK8、PtCPKl4PtCPK31、PtCPKIO 較高，這些基因可能參與了楊樹莖的次生生長(圖Pt

22、CPK28、PtCPKl3PtCPK23、PtCPKl6PtCPKl8、 4A)。對不同組織中CDPKs表達情況進行分析，發(fā)PtCRK6PtCRK3、PtCRKlPtCRKIO、PtCRK2Pt現(xiàn)PtCPKl6、PtCPKl8、PtCPKl9和PtCPK32在根中 CRK8及PtCRK5PtCRK7。這些基因對不僅在蛋白表達較高，PtCPK3、PtCPKl3及PtCPKl4在雄花中 水平上有很高的相似度，而且內含子的插入大小和表達較高，PtCPK4、PtCPKll及PtCPK24在幼苗中 插入位點也非常保守(圖3)，這些基因對是由于染 表達較高，這些基因的組織表達差異說明它們可能 色體復制造成

23、的。參與了不同組織的發(fā)育進程(圖4B)。23楊樹CDPK基因的表達特性 24楊樹CDPK基因在次生維管再生系統(tǒng)不同時基因的表達特性能夠對基因的功能提供一些線期表達分析索。為了檢測楊樹中CDPKs基因的表達特性，利用 作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，楊樹CDPK基因家族中7萬方數(shù)據(jù)林業(yè)科學研究第27卷A9嬲CPKi22苧=幡-耩it薛絮?神轉吲I罐；黑；：=囂=o一1“-瑚一-眥川。!：蟹?譬，篙tCR竺K：=：=鬻H哪PtCPK2： !=_：竺11簍7j：；荔 二。：。：二。=。：tCPK21竺!一=，o州：tC PK2翌I一州魯一h眥um朋an：iZ螂磊IH終1：贏磊。淼LHJ：外顯子一內含子0 1 k

24、b圖3楊樹及擬南芥CDPK基因的內含子結構個成員(PtCPKl、PtCPK3、PtCPK4、PtCPK6、 為了更好的研究基因的功能，分析了毛白楊 PtCPKl5、PtCPK23及PtCPK26)在毛白楊剝皮后次 PtCPKl、PtCPK6及PtCPKl5在細胞中的亞細胞定位。 生維管再生系統(tǒng)不同時期表達量有變化。本文利用 通過軟件分析序列，顯示這幾個蛋白均存在一個跨膜 Realtime PCR分析這7個CDPK基因在毛白楊剝皮 區(qū)。將PtCPKl、PtCPK6及PtCPKl5基因分別與YFP 再生不同時期的表達量。次生維管再生第1012 黃色熒光蛋白構建融合表達載體，注射煙草下表皮葉 天為次

25、生維管系統(tǒng)重建的關鍵時期，研究發(fā)現(xiàn)， 片瞬時表達，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，選取 PtCPKl、PtCPK6及PtCPKl5在次生維管再生第10、 的PtCPKl、PtCPK6及PtCPKl5定位在細胞膜上，這12天表達顯著增加，說明它們可能在次生維管系統(tǒng)與通過序列分析預測的結果一致(圖7)。 重建過程中起調控作用(圖5)。3討論與結論25楊樹PtCPKl、PtCPK6及PtCPKl5的組織表達及亞細胞定位分析 本研究利用的擬南芥CDPK蛋白序列在楊 在圖6中，分別分析了PtCPKl、PtCPK6及樹數(shù)據(jù)庫中進行搜素，共找到32個CDPK基因及l(fā)o PtCPKl5在毛白楊根、葉片、莖段、包

26、含韌皮部區(qū)域 個CRK基因，其中，包含14個CDPK基因對及4個 的形成層以及包含未成熟木質部區(qū)域的形成層中的CRK基因對，這些基因是在植物進化過程中染色體 表達情況，PtCPKl 5在各組織中的表達量均較高。 復制產生的。植物體內的CDPK以多成員組成的基萬方數(shù)據(jù)一第5期張進等：楊樹CDPK基因家族的表達分析及功能預測一609一一A IN2IN3 IN4 IN5IN9 B RT RF MFFF S AB SAPtC尸KjPt(1P刪PtcPK2PtcPK2PtCPK3PtcPK3PtcPK4PtCPK4PtcPK5PtCPK5PtCPK6 PtCPK6PtCPK7 PtCPK?PtCPK8

27、PtCPK8PtcPKloPtCPKloPtCPKll PtCPKPtcPKl2 PtcPKl2PtCPKl3PtcPKl3PtcPKl4PtCPKl4PtcPKl5PtcPKl5PtcPKl6 PtCP肌6PtcpKl7 PtCPKl 7PtcPKl8PtcPKl8PtCPKl9ptcPKl9PtcPK20PtcPK20PtcPK2iPtcPK2iPtcPK22PtCPK22PtCPK23PtcPK23PtCPK24PtcPK24PtCPK25PtCPK25PtcPK26 PtcPX26PtCPK27 PtcPK27PtcPK28 PtcPK28PtcPK29PtcPK29PtCPK30Pt

28、cPK30PtcPK3lPtCPK31PtcPK32PtcPK32ptC只KjPtCRKlPtCRK2 PtCRK2PtC肼3 PtCRK3PtCRK4PtcRK4PtCRK5PtcRK5PtcRK6PtCRK6PtC品7 PtCRK7PtCRK8PtcRK8PtcRK9PtcRK9PtCRKl0 PtCRKlo15100101 一0402010(j l02 04基因在楊樹不同節(jié)間的表達特性(GEO：GSEl3043)，IN2一第2節(jié)間，IN3一第3節(jié)問，IN4一第4節(jié)問，IN5，第5節(jié)間，IN9一第9節(jié)間 B楊樹CDPKs基因在楊樹不同組織中的表達特性(GEO：GSE21481)，RT(組培

29、條件下的根)，RF(野生條件下的根)，MF(雄花芽)，F(xiàn)F(雌花芽)，S(幼苗)，AB(腋芽)，sA(莖尖) 圖4楊樹CDPK基罔表達特性20181614璺12懈10蓬s642OPtCPK4 PtCPK26 PtCPK6 PtCPKl PtcPK23 PtCPK3 Pt(1PKl5基因名圖5 Real-time PCR分析楊樹次生維管系統(tǒng)再生不同時期CDPKs毖因表達因家族形式存在，并通過各自的結構特征和功能，分 發(fā)育階段及次生維管再生過程中的表達情況進行分 別介導其自身生長發(fā)育信號及外界脅迫刺激信號的析，發(fā)現(xiàn)其家族成員在不同條件下的表達明顯不同， 信號轉導。前人已在多種植物中鑒定了許多CDP

30、K說明它們可能執(zhí)行特定的生物學功能。本研究中選 基因并對其功能進行了研究，但對于木本模式植物 取3個CDPK基因(PtCPKI、PtCPK6、PtCPKl5)，對 中CDPK基因家族的研究并不系統(tǒng)。因此，楊樹 其亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其均為膜定位蛋白，而位于 CDPK基因家族的發(fā)現(xiàn)對于研究楊樹生長發(fā)育有著CDPK基因N末端的豆蔻?；稽c是膜定位所必須 重要的意義。 的。外界信號導致的細胞質內增多的ca2+，主要來對楊樹CDPK基因家族成員在不同組織、生長臼于細胞內的ca。庫，通過位于細胞質膜上的鈣離萬方數(shù)據(jù)610林業(yè)科學研究第27卷子通道進入胞質。因此，植物細胞膜上廣泛分布著l2345各種鈣離子

31、轉運體，但各自轉運體的調控機制不同，ptCPKl一分別或協(xié)同完成植物細胞信號轉導過程。近年來，PtcpK6通過對擬南芥、水稻等植物的研究說明，在34個擬南芥CDPK成員和31個水稻CDPK成員中，多數(shù)PtCPKl5CDPK與逆境信號轉導有關。Sheen舊21發(fā)現(xiàn)，在干旱和鹽誘導條件下，擬南芥AtCPKl和AtCPK2的 表達量顯著增加，擬南芥AtCPKIO和AtCPK30參與卜根，2一葉，3一莖，4一形成層(含韌皮部)，5一形成層(含未成熟木質部)了對ABA和非生物脅迫的信號轉導。本研究中發(fā)現(xiàn)，楊樹CDPK基因家族中有些成員在次生維管組圖6楊樹PtCPKl、PtCPK6及PcP硒5的組織表達分

32、析2000一1000i0一i000叫2000PtcPXl-300040005000籟嘹器釋茵婆瞥600070000 100 200 300 400 500 60020001000i0州10002000PtcPK6 30004000-5000藉瞵蠡聰毯型留6000200010000100020003000PtcPKl540005000赧峨囂翳豎鳘齠6000圖7楊樹PtCPKl、PtCPK6及PtCPKl5基因跨膜區(qū)結構預測及亞細胞定位分析織發(fā)育中高表達，但其具體的功能目前尚不清楚，本Calcineurin Blike Proteins Calcium Sensors for Specific S

33、ignal Re- in PlantsJPlant1)：$389文作者正在開展進一步的研究，以便為探究其在木sponse Coupling Cell，2002，14(suppl一$400材發(fā)育過程中的功能奠定根底。4Reddy A SCalcium：silver bullet in signalingJPlant Science，2001，160(3)：381404參考文獻：5Sanders D，Pelloux J，Brownlee C，et a1Calcium at the crossroadsITrewavas A J，Malh6 RCa2+signalling in plant cell

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42、investigate gene cx-14Yang T，Poovaiah BCalciumcalmodulinmediated signal network prvssion by a proteomic approachJProteomics，2006，6：881in plantsJTrends in Plant Science，2003，8(10)：50589515Wemimont A K，Amani M，Qiu w，et a1Structures of parasitic 26Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et aThe CLUSTALX CDP

43、K domains point to a conlnlon mechanism of activationJ windows interface：flexible strategies for multiple sequence align- Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，201 1，79(3)： ment aided by quality analysis toolsJNucleic Acids Research，8038201997，25(24)：4876488216Wernimont A K，Artz J D，Jr Finerty P，et a1Structures of api 27Tamura K，Peterson D，Peterson N。et a1MEGA5：molecular evo- complexan calciumdependent protein kinases reveal mechanism of lutionmy genetics analysis using maximam likelihood，evolutiona