水通道蛋白的基本結(jié)構(gòu)與特異性通透機(jī)理

1、水通道蛋白的基本結(jié)構(gòu)與特異性通透機(jī)理王晶 桑建利（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875）摘要 水通道蛋白是一個(gè)具有跨膜運(yùn)輸水分子功能的蛋白家族。從1988 年Agre 等發(fā)現(xiàn)水通道蛋白起，目前在不同物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200 余種水通道蛋白，其中存在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的有13 種。概述了水通道蛋白的結(jié)構(gòu)、組織特異性分布及特異性通透機(jī)理。關(guān)鍵詞 水通道蛋白 水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)維持不同區(qū)域的液體平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)非常重要。水分子作為一種不帶電荷且半徑極小的極性分子，很早被證實(shí)能通過(guò)自由擴(kuò)散穿透脂質(zhì)雙分子層。在發(fā)現(xiàn)水通道蛋白以前，人們一直認(rèn)為這是水分子透過(guò)質(zhì)膜的唯一方式。但通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅

2、細(xì)胞和腎小管細(xì)胞中水的通透速率之快遠(yuǎn)非簡(jiǎn)單擴(kuò)散強(qiáng)度所能提供的， 因此猜測(cè)，質(zhì)膜上可能存在某種通道介導(dǎo)水的轉(zhuǎn)運(yùn)。1 水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)1988年，Agre 等從人類(lèi)紅細(xì)胞膜上純化分離分子量為32106 的Rh 多肽時(shí)，偶然鑒定到一種新的分子量為28106 的整合膜蛋白， 并且通過(guò)免疫印跡發(fā)現(xiàn)這類(lèi)蛋白也存在于腎臟的近端腎小管中1，把它稱(chēng)為類(lèi)通道整合膜蛋白（channel-like integralmembrane protein, CHIP28）。隨后，在1991 年Agre和Preston 成功克隆得到了CHIP28 的cDNA，通過(guò)分析其編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CHIP28 含有6個(gè)跨膜區(qū)域、2個(gè)

3、N-糖基化位點(diǎn)、且N 端和C 端都位于膜的胞質(zhì)一側(cè)。另外，對(duì)比CHIP28 與早期從牛晶體纖維中克隆得到的主要內(nèi)源性蛋白（major intrinsicprotein,MIP）的DNA 序列，發(fā)現(xiàn)二者具有高度同源性。由于很早以前就證實(shí)了MIP 家族的成員蛋白參與形成允許水和其他小分子通透的膜通道，因此，推測(cè)CHIP28 可能也具有類(lèi)似功能2。1992 年，Preston 等通過(guò)在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中表達(dá)CHIP28， 首次證實(shí)它是一種水通道蛋白。非洲爪蟾的卵母細(xì)胞對(duì)水具有極低的滲透性，當(dāng)向其中顯微注射體外轉(zhuǎn)錄的CHIP28 的RNA后，卵母細(xì)胞在低滲溶液中迅速膨脹，并于5 min內(nèi)破裂。這一現(xiàn)

4、象表明注射CHIP28 的RNA 后卵母細(xì)胞膜的水通透性有了明顯提高。為了進(jìn)一步確定CHIP28 的功能，將提純的CHIP28 構(gòu)建在蛋白磷脂體中， 構(gòu)建后的蛋白磷脂體對(duì)水的通透性增長(zhǎng)了50 倍，但對(duì)尿素卻不具備通透性3。這些結(jié)果最終證實(shí)了CHIP28 為水通道蛋白， 后來(lái)它被命名為水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP1）。水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)，開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。隨著更多亞型的發(fā)現(xiàn)， 水通道蛋白相關(guān)研究成為了膜轉(zhuǎn)運(yùn)方向的研究熱點(diǎn)，Agre 也因其對(duì)水通道蛋白做出的突出貢獻(xiàn)而獲得2003 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2 水通道蛋白的分子結(jié)構(gòu)水通道蛋白分布廣泛，目前已在哺乳動(dòng)物、兩棲類(lèi)、植物、酵母、

5、細(xì)菌以及各種各樣的有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)水通道蛋白的存在。水通道蛋白是一類(lèi)高度保守的疏水小分子膜整合蛋白， 各種亞型之間蛋白序列及三維結(jié)構(gòu)非常相似。哺乳動(dòng)物水通道蛋白的分子大小在2610634106 之間， 氨基酸序列同源性為19%52%4。因水通道蛋白的三維結(jié)構(gòu)相似，一般以AQP1的結(jié)構(gòu)作為代表。AQP1 是一條由269 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單肽鏈，對(duì)比AQP1 分子前后半段的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)2 段序列具有相關(guān)性，推測(cè)AQP1在進(jìn)化上可能是通過(guò)基因復(fù)制而來(lái)。單肽鏈在細(xì)胞膜上往返折疊形成6 個(gè) 螺旋的跨膜區(qū)域， 并且肽鏈的N 端和C 端都位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)；6 個(gè)跨膜區(qū)域由5 條環(huán)（AE loop）相連。目前，

6、被人們廣為接受的水通道蛋白三維結(jié)構(gòu)是“ 沙漏模型（hourglassmodel）”4，模型指出：肽鏈中的B 環(huán)和E 環(huán)具有高度保守的天冬酰胺- 脯氨酸- 丙氨酸（Asn -Pro -Ala，NPA）特征性序列，B 環(huán)和E 環(huán)折返進(jìn)入膜雙分子層，2個(gè)保守的NPA 序列在膜的磷脂雙層中間位置相互結(jié)合，6 條跨膜區(qū)域在四周包圍， 共同構(gòu)成了一個(gè)供水分子通過(guò)的親水通道（圖1）。通過(guò)對(duì)AQP1 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，B環(huán)和E 環(huán)折返入膜后分別形成短螺旋B（HB）和短螺旋E（HE），中心孔道處起穩(wěn)定作用的2 條NPA基序幾乎呈90交叉，所形成的親水通道的直徑約為2.81010 m，剛好能容納單個(gè)水分子

7、通過(guò)，外圍6 條跨膜區(qū)域呈現(xiàn)右手螺旋包圍。構(gòu)成中心孔道表面的除B 環(huán)和E 環(huán)外，還有螺旋2、5 以及螺旋1、4 的C 端部分。有研究指出，將B 環(huán)和E 環(huán)聯(lián)系在一起的作用力主要是2 條NPA 基序中脯氨酸殘基間的范德華力，同時(shí)也受到離子鍵和氫鍵的穩(wěn)定。幾乎所有AQP 分子的B 環(huán)和E 環(huán)上都有高度保守的NPA 特征性序列。但也有少數(shù)例外： 在A(yíng)QP11 和AQP12 中僅發(fā)現(xiàn)E 環(huán)上具有NPA 序列，另一個(gè)在B 環(huán)上的NPA 序列分別由天冬酰胺-脯氨酸-半胱氨酸（Asn-Pro-Cys,NPC）和天冬酰胺-脯氨酸-蘇氨酸（Asn-Pro-Thr,NPT）替代6。在體內(nèi)，AQP1 主要以同源四聚

8、體的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，四聚體中某個(gè)水通道蛋白單體發(fā)生突變并不會(huì)影響其他3 個(gè)蛋白單體的功能，即每一個(gè)水通道蛋白單體是一個(gè)獨(dú)立的功能單位。水分子的跨膜滲透是通過(guò)水通道蛋白單體的中心通道完成的，而無(wú)法通過(guò)中聚體的中央孔洞（4 個(gè)單體銜接處的中心縫隙）7。每個(gè)單體通過(guò)跨膜的 螺旋與鄰近的2 個(gè)單體相互作用。這些相互作用很有可能受到一些氨基酸殘基之間的氫鍵的穩(wěn)固。3 水通道蛋白的種類(lèi)迄今為止，已有200 余種水通道蛋白在不同物種中被發(fā)現(xiàn)， 其中存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的水通道亞型有13 種，即AQP0-AQP12（見(jiàn)下表）。根據(jù)它們的基因結(jié)構(gòu)和通透性，這13 種水通道蛋白可劃分為3 組： 傳統(tǒng)水通道蛋白（

9、orthodox aquaporins）（ 包括AQP0、1、2、4、5、6、10）、甘油水通道蛋白（aquaglyceroporins）（ 包括AQP3、7、9） 和未明確分類(lèi)的AQP8、11、12。目前對(duì)哺乳動(dòng)物中較早發(fā)現(xiàn)的10 個(gè)水通道蛋白AQP0AQP9 研究較為透徹， 它們的功能也通過(guò)人類(lèi)疾病的鑒定及對(duì)基因缺失小鼠的研究而被鑒定； 而較近發(fā)現(xiàn)的3 個(gè)成員AQP10AQP12 則相對(duì)研究較少，它們的胞內(nèi)定位及表達(dá)異常導(dǎo)致的人類(lèi)疾病都還未被鑒定8。4 水分子特異性通透機(jī)理水通道蛋白對(duì)水分子具有高度選擇性。大部分水通道蛋白嚴(yán)格排斥除水分子以外的所有物質(zhì)通過(guò)， 包括結(jié)合水分子的氫離子（ 水合

10、氫離子，H3O+）、甘油和各種離子等，但也有部分水通道蛋白對(duì)甘油等小分子中性溶質(zhì)具有通透性。AQP1膜蛋白的密度可達(dá)到大于109 個(gè)/m2，。這一密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普遍的離子通道的密度（除突觸后膜上的乙酰膽堿受體外，大多小于1 個(gè)/m2）。水通道蛋白是怎樣對(duì)水分子進(jìn)行嚴(yán)格篩選的呢？ 首先，通道的空間大小只能容納單個(gè)水分子，限制了比水分子大的分子通過(guò)。以對(duì)水分子具有專(zhuān)一通透性的AQP1 為例，AQP1 的中心通道呈啞鈴狀，狹口處在脂雙層中央B 環(huán)和E 環(huán)相互作用的NPA 序列位置附近。構(gòu)成中心孔道表面的氨基酸殘基中，親水和疏水的殘基數(shù)量基本是對(duì)等的。這些親水殘基在對(duì)水分子去水化過(guò)程中有重要作用。另外，

11、中心孔道最窄處由4 個(gè)殘基構(gòu)成，包括親水的His180、Arg195、Cys189 和疏水的Phe56。雖然這一縮口只有1 個(gè)氨基酸殘基的跨度， 但是它2.81010 m 的直徑仍然阻斷了比水分子大的離子和溶質(zhì)的通過(guò)。因此，這4 個(gè)殘基的變化都可以對(duì)水通道的選擇性產(chǎn)生影響。根據(jù)已有研究可知，His180 在只對(duì)水具有通透性的水通道蛋白中高度保守， 但在一些對(duì)甘油也具通透性的水通道蛋白，如GlpF 中則被甘氨酸殘基代替11。另一個(gè)困擾人們已久的問(wèn)題是何種機(jī)制阻斷了水道蛋白對(duì)質(zhì)子的跨膜運(yùn)輸。早在短桿菌肽中的研究就已表明， 水可以以連續(xù)不斷的方式通過(guò)膜上的開(kāi)放孔,這種水分子排列成一條直線(xiàn)、質(zhì)子由一個(gè)

12、水分子傳遞到另一個(gè)水分子、并伴隨著氫鍵的斷裂和重建的過(guò)程，被研究者稱(chēng)為“Grotthus 效應(yīng)”。既然水通道蛋白對(duì)水具有特異通透性, 那么可通過(guò)“Grotthus效應(yīng)”傳遞的質(zhì)子運(yùn)輸又是怎樣被阻斷的呢？目前被較多人接受的另一個(gè)機(jī)制是在NPA 序列處有1對(duì)偶極子對(duì)水分子起著定向作用。在每個(gè)水通道的中心位置，NPA 序列上的Asn76 和Asn192 的氨基向孔道最窄處延伸。此時(shí)，位于此處的水分子與其鄰近的水分子之間的氫鍵發(fā)生斷裂，其氧原子替代性地與Asn76 和Asn192 的氨基形成氫鍵。這一變化重排了水的分子軌道，使最窄處水分子的2 個(gè)氫原子定向到與通道軸線(xiàn)垂直的方向（圖2）。因此，中心處水

13、分子的2 個(gè)氫原子無(wú)法與周?chē)徑乃肿有纬蓺滏I；另外，在通道最窄處的殘基附近的氨基酸殘基都是疏水的，因此不會(huì)有另外的殘基與水分子的2 個(gè)氫原子形成氫鍵。這一模式使得位于通道上下2 部分中的水分子在取向上相反，不利于形成氫鍵鏈，從而也阻斷了質(zhì)子通過(guò)“Grotthus 效應(yīng)”完成連續(xù)傳輸，同時(shí)，因?yàn)槭杷被岵粎⑴c形成氫鍵，也保證了水分子在通過(guò)孔道時(shí)只需要跨越一個(gè)相當(dāng)?shù)偷哪芰空系K7，12。a：NPA 基序上的偶極矩改變了中心水分子的定向， 使通道上下水分子取向相反。b，c：水分子與Asn192、Asn76 的氨基形成氫鍵，水分子的2 個(gè)氫原子重定向至與通道軸線(xiàn)垂直7據(jù)已有研究， 水通道蛋白幾乎嚴(yán)

14、格排斥其他所有離子。從理論上來(lái)說(shuō)， 水合化的離子直徑為7.161010 m，而去水合化的離子只有1.91010 m的直徑，是可以通過(guò)最窄處為2.81010 m 的中心通道的?？椎廓M窄的陽(yáng)離子通道就具有使離子去水合化的能力， 如KcsA 鉀通道中就有16 個(gè)羰基氧以4 個(gè)每環(huán)的結(jié)構(gòu)垛疊排列， 這一結(jié)構(gòu)具有分離與離子水合的水分子的能力。而AQP1 中孔道中的羰基氧的結(jié)構(gòu)雖然足以分離體相水中的水分子，但是只能使水合離子部分去水合化，而后者則因直徑仍大于狹口直徑而無(wú)法通過(guò)水通道13。主要參考文獻(xiàn)1 Denker B.M.， Smith B.L.， Kuhajda F.P. et al . Identification，purification， and partial characterization of a novel Mr 28000integral membrane protein from erythrocytes and renal tubulesJ Biol Chem，1988，263(3):15634.2 Preston G. M.， Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyteintegral membrane protein of 28 kilodaltons:member of an ancient