豬丹毒桿菌檢驗(yàn)

1、關(guān)于豬丹毒桿菌的檢驗(yàn)第一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握豬丹毒桿菌檢驗(yàn)的基本原理和方法；2、了解檢驗(yàn)豬丹毒桿菌的意義。第二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、實(shí)驗(yàn)說明 豬丹毒(Swine erysipelas)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一種人畜共患傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。 豬丹毒桿菌分為兩個(gè)種，即紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌，其中僅紅斑丹毒絲菌是具有致病力的毒力種，對(duì)豬最易感并有很強(qiáng)的致病性，至今已發(fā)現(xiàn)la, 1b, 2-2

2、4和N型共26個(gè)血清型，大約80%以上的豬源性分離株屬1型(la和1b)和2型，我國(guó)優(yōu)勢(shì)血清型也為1a, 1b和2型。 第三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月“大紅袍”類丹毒不規(guī)則鮮紅色斑塊 第四張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月大紫腎 ：典型的敗血脾;腎淤血、腫大 心瓣膜增生 ：疵狀心內(nèi)膜炎的病變，二尖瓣和主動(dòng)脈瓣出現(xiàn)菜花樣增生物 脾充血腫大 第五張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、檢驗(yàn)程序第六張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作步驟（一）增菌 以無菌操作取檢樣，用乳缽加滅菌砂磨碎，無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于36士1培養(yǎng)8 h10h。（二）分離和

3、培養(yǎng) 對(duì)沒有受污染的新鮮病料可直接接種在血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)2448h?；蚪?jīng)TSB肉湯37培養(yǎng)24h后，再轉(zhuǎn)種于血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24h。第七張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 血清瓊脂：菌落特征：細(xì)小、圓形、透明、凸起、灰白色、有光澤、質(zhì)軟、露珠樣、易混懸于鹽水中。第八張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄溶血環(huán)（溶血） 第九張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月TSB肉湯：輕度混濁，振動(dòng)試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌環(huán)。第十張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于202

4、2年6月革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，菌體細(xì)長(zhǎng)、長(zhǎng)短不一，有時(shí)呈長(zhǎng)絲形，單獨(dú)存在，有時(shí)呈短鏈或V形排列。第十一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作步驟（三）生化實(shí)驗(yàn)自TSA瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺。以無菌操作將各菌分別穿刺接種至SIM培養(yǎng)基中，將所有試管置于37下培養(yǎng)24-48小時(shí)。第十二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月如試管5：本試驗(yàn)可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。第十三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作步驟（三）生化實(shí)驗(yàn)將被檢菌穿刺接種于明膠

5、培養(yǎng)基，于20培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高，培養(yǎng)基自行溶化時(shí)，可與冰箱內(nèi)放置30分鐘，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固時(shí)為陽性。V-P試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)檢驗(yàn)。第十四張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作步驟（三）生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果葡萄糖枸鹽酸鹽-乳糖靛基質(zhì)-果糖硫化氫蔗糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-鼠李糖-木糖-M.R.(甲基紅 )-V-P-氧化酶-過氧化氫酶 -硝酸鹽還原-明膠不液化注：表示陽性; 表示陰性。 第十五張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 豬丹毒桿菌的檢

6、測(cè)步驟1、引物：P1：5-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3P2：5-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3第十六張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟2、反應(yīng)體系 反應(yīng)總體積為25 L ，其中含有12.5 L的PCR Master Mix， 10 mol/L上、下游引物各1 L, 1 g/L DNA模板5 L ，滅菌雙蒸水6.5 L 。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 第十七張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟3、反應(yīng)條件： 95，5min 95，1m

7、in 63，1min 40次循環(huán) 72，1min 72，10min（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 第十八張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟4、DNA的提取： 將被檢菌株接種于3 mL TSB肉湯中，37振蕩培養(yǎng)(150 r/min) 1012h后，取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，經(jīng)12000 r/min 4離心5 min，棄去上清液，用200L ddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10 min，隨

8、后立即在冰中冷卻，然后在12000 r/min及4條件下離心5 min，取上清液為豬丹毒桿菌基因組DNA模板。第十九張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟5、電泳檢測(cè)：取5L PCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5g/mL溴化乙錠 ）電泳，凝膠成像儀上觀察拍照結(jié)果。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 第二十張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月937bp M 1 2 3 420001000750500250100豬丹毒桿菌PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖說明：MDL2000；1陽性對(duì)照；2、3被檢樣品；4陰性對(duì)照。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 第二十一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作步驟四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性昆明小鼠，體重1822g 器材：1ml注射器，鼠籠，墊料（所有器皿均經(jīng)高壓消毒）。第二十二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、操作步驟四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2.實(shí)驗(yàn)步驟每組取2只小鼠，以每只0.2mL劑量進(jìn)行一次性腹腔注射1只，另一只注射0.2mL無菌生理鹽水，觀察，分別記錄小鼠死亡狀況。 第二十三張，PPT共二十五頁