血紅蛋白電泳意義和判斷

1、目的血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的回顧Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血紅蛋白檢測(cè)說(shuō)明血紅蛋白臨床結(jié)果說(shuō)明2血紅蛋白的結(jié)構(gòu)血紅蛋白分子是由4條多肽鏈(2對(duì))和4個(gè)可以結(jié)合鐵和氧氣的血紅素. Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.3三維結(jié)構(gòu)4 亞單位2 alpha鏈2 alpha genes3 非 alpha鏈 : beta, delta, gamma1 b gene , 1 d gene , 2 g genes正常結(jié)果Hb A: a2b2Hb F: a2g2Hb A2:a2d

2、2 +-瓊脂糖凝膠 Hydrasys (Sebia)堿性緩沖液成人新生兒血紅蛋白遺傳病類型(HEMOGLOBINOPATHIES) ?血紅蛋白疾病血紅蛋白性質(zhì)變化 : 血紅蛋白分子病結(jié)構(gòu)異常, 一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸變異或缺失, 都將會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白分子的電性發(fā)生改變 常見(jiàn)血紅蛋白變異體b-globin : S C DPunjab E血紅蛋白含量變化 : 地中海貧血合成或合成調(diào)控異常 :b globin b Thalassemiasa globin a Thalassemias合并型 : 血紅蛋白分子病Hemoglobinopathies /地貧 Thalassemias血紅蛋白遺傳病遺傳性疾病基因?qū)W

3、圖譜正常基因異?；虍惓Ｑt蛋白類型目前, 已經(jīng)證實(shí)的有超過(guò)1000 種以上的變異體(a, b, g and d)大部分變異體出現(xiàn)頻率較低, 并且沒(méi)有明顯臨床癥狀4種主要變異體 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出現(xiàn)頻率較高 ( 特定人群)攜帶者會(huì)出現(xiàn)健康問(wèn)題兒童可能在出生時(shí)即伴隨有嚴(yán)重癥狀血紅蛋白疾病的區(qū)域分布圖Thalassemias常見(jiàn)與地中海區(qū)域: 意大利, 西班牙,希臘, 近東地區(qū), 非洲北部.同樣常見(jiàn)于東南亞 : 泰國(guó),印度, 越南,中國(guó), 印尼. 臨床癥狀* Beta 地貧重癥型 - 嚴(yán)重貧血 (需要長(zhǎng)期輸血治療)* Beta 地貧中間型* Bet

4、a 地貧輕微型 - 無(wú)臨床癥狀Beta 地中海貧血 常見(jiàn)區(qū)域bo 沒(méi)有Beta鏈合成b+ 合成能力下降A(chǔ)lpha 地中海貧血 臨床癥狀: 根據(jù)Alpha基因的表達(dá)狀態(tài), 有4個(gè)不同程度的Alpha地貧癥狀* 1 個(gè)基因表達(dá)沉默: 靜止型 (非常難檢測(cè)到, 在出生會(huì)測(cè)到Hb Barts 1-2% )* 2 個(gè)基因表達(dá)沉默: 輕型alpha地貧,在出生會(huì)測(cè)到Barts 2-10%* 3 個(gè)基因表達(dá)沉默: 血紅蛋白Hb H病, 出生時(shí)出現(xiàn)2-30% Barts, 兒童-成人出現(xiàn) 10-15% Hb H* 4 個(gè)基因表達(dá)沉默: Hb Barts胎兒水腫綜合征 (死胎) 常見(jiàn)區(qū)域 常見(jiàn)與遠(yuǎn)東地區(qū),非洲和

5、地中海區(qū)國(guó)家其他特征Hb HHb A2Hb F貧血小紅細(xì)胞靶細(xì)胞異常出生時(shí)少量的 (2%) Hb Barts0正常正常000一條鏈缺失出身時(shí)Hb Barts (5%)0正?；驕p少正常0002條鏈缺失不穩(wěn)定血紅蛋白溶血性貧血 (Hb H)10-15%減少也許增加輕微的到嚴(yán)重的+3條鏈缺失胎兒水腫綜合癥 (hydrops fetalis)00100 % Hb Barts嚴(yán)重的-4條鏈缺失基因型診斷血常規(guī)臨床癥狀檢測(cè)結(jié)果aa/aa無(wú)Hb A: NHbA2: N (2-3.5%)-a/aaa-Thalassaemia 2 雜合體(靜止型)輕微小紅細(xì)胞癥MCV: 75-80fLMCH: 20-24無(wú)Hb

6、 A and HbA2: NHb Barts 0-3% at birthConfirmation by molecular biology-a/-aa-Thalassaemia 2 純合體小紅細(xì)胞癥血紅蛋白減少Hb: 11-12 g/dL無(wú)明顯臨床癥狀Hb A and HbA2: NHb Barts 2-8% at birth- -/aaa-Thalassaemia 1 雜合體MCV: 65-75 MCH: 20-24需要分析序列分析或DNA序列分析 - -/-aHbH小紅細(xì)胞癥血紅蛋白減少Hb: 8-11 g/dLMCV: 55-65 MCH: 20-24出現(xiàn)溶血脾臟腫大HbA2 N or

7、Hb Barts 5%Hb H 10-20%- -/- -a-Thalassaemia 1 純合體(死胎)嚴(yán)重貧血 水腫胎Hb: 8-11 g/dLMCV 100-110 MCH 無(wú)法存活死胎Absence of HbA and HbFHb Barts 80-100%Hb Portland 5%鐮刀型紅細(xì)胞血癥變異體出現(xiàn)在 6 GAG (谷氨酸) GTG (纈氨酸)NSSASabnormal gene normal gene NHbSNNHbS ASNHbAHbSNNSSHbAHbSChromosomes 16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes 11Htrozygote

8、dbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes 16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes 11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgC型血紅蛋白分子病 變異體位置:AA 6: GAG (谷氨酸) AAG (Lys)HbA Heterozygote ACHbAHbCNHbASC Compound heterozygotyHbAHbCNHbSHtrozygote compositeACSCChromosomes 16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes 11HtrozygotedbdbAgAgGg

9、GgdbdbAgAgGgGgChromosomes 16a2a1a2a1SC heterozygote compoundChromosomes 11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgD型血紅蛋白分子病常見(jiàn)區(qū)域:常見(jiàn)于印度.特點(diǎn): 變異體位置 b121 Glu (谷氨酸,負(fù)電荷) Gln (谷氨酰胺, 不帶電荷) (D- Los Angeles = D-Punjab)(6 different Hb D according to the position of the mutation)堿性緩沖液中: 電荷下降 M電泳速度變度變慢,靠近Hb S臨床癥狀:基因雜

10、合體:無(wú)癥狀 (僅在電泳中發(fā)現(xiàn)D區(qū)帶)Hb A fraction: 65 70 %Hb D fraction: 30 35 %基因純合體:輕微貧血Hb A fraction: absenceHb D fraction: 100 %E型血紅蛋白分子病常見(jiàn)區(qū)域:常見(jiàn)與東南亞地區(qū).特點(diǎn): 變異位點(diǎn) b26 Glu (谷氨酸,負(fù)電荷) Lys (賴氨酸,正電荷)堿性緩沖液: 總體帶電荷下降 凝膠電泳中,出現(xiàn)在HbC附近臨床癥狀:雜合體:無(wú)癥狀Hb A fraction: 65 70 %Hb E fraction: 30 35 %基因純合體:輕微貧血Hb A fraction: absenceHb E

11、fraction: 100 %下列情況下,需要進(jìn)行血紅蛋白檢測(cè) 臨床和遺傳問(wèn)題 (產(chǎn)前診斷) 貧血,小紅細(xì)胞癥 新生兒篩查 對(duì)來(lái)自地貧高發(fā)區(qū)人口,進(jìn)行篩查 對(duì)診斷有幫助的其他信息 患者臨床癥狀,年齡,籍貫和其他相關(guān)的背景 (輸血記錄) 血液全套檢測(cè), 網(wǎng)狀細(xì)胞級(jí)別和進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)鏡檢 Hb電泳 (EDTA抗凝管) 離子平衡和溶血情況 血紅蛋白檢測(cè)的幾種方法目前, 血紅蛋白檢測(cè)步驟如下:- 電泳法對(duì)Hb進(jìn)行檢測(cè)或者使用等電聚焦電泳法- 使用 HPLC法進(jìn)行確認(rèn).凝膠電泳結(jié)果識(shí)別表 20在pH梯度的凝膠片上, 根據(jù)蛋白不同的等電點(diǎn),對(duì)蛋白進(jìn)行分離 Hb電泳位置取決于緩沖液PH值蛋白電泳至其等電點(diǎn)位置

12、后,停止泳動(dòng)At pI=pH, Hb does not have a net charge and stops migrating電泳分離效果好, 但時(shí)間長(zhǎng).需要經(jīng)驗(yàn)豐富才能獲得良好結(jié)果及進(jìn)行結(jié)果判斷等電聚焦電泳法21介于普通電泳和等電聚焦電泳之間的新方法:- 通過(guò)毛細(xì)管電泳法, 即可以獲得與IEF方法一樣的分辨率,同時(shí)檢測(cè)結(jié)果量值Hb A2/Hb F同樣精確.- 出現(xiàn)異常變異體后:使用下列方法確認(rèn):* ITANO test (solubility test)* HPLC液相色譜* Genotyping基因篩查Capillarys 2Minicap全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法進(jìn)行血紅蛋白檢測(cè) Capil

13、larys 2 / Minicap毛細(xì)管電泳法原理 Peltier溫控橋Anode +Cathode -檢測(cè)器氘光燈電泳高電壓此時(shí),電滲力(EOF)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于電場(chǎng)力.因此,蛋白被動(dòng)從正極向負(fù)極端移動(dòng).正電極 +EOF負(fù)電極-Electro migration蛋白電泳DETECTIONINJECTION帶正電荷的緩沖液毛細(xì)管壁負(fù)離子鞘Capillarys/Minicap血紅蛋白電泳血紅蛋白條帶,在電滲力的作用下,8分鐘即完成電泳過(guò)程, 然后,在415nm紫外光下被檢測(cè)并顯示出來(lái).正常質(zhì)控品 必須在每天檢測(cè)前使用Capillarys :- 檢測(cè)速度: 40 樣品/小時(shí)試管架1 至 7號(hào)位放置樣品,

14、8號(hào)位放 4ml溶血素Minicap :- 檢測(cè)速度: 10 樣品/小時(shí)試管架1 至 26號(hào)位放置樣品, 27號(hào)位放溶血素(8個(gè)樣品消耗5ml溶血素)Capillarys/Minicap血紅蛋白檢測(cè)標(biāo)本要求抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需要對(duì)輸血患者采血, 需要在輸血前采集血液.使用去除血漿后的紅細(xì)胞(隔夜或5000 rpm,5分鐘離心后樣品) + 4C以上, 標(biāo)本最多存放7天.需要長(zhǎng)期存放, 可以洗滌紅細(xì)胞后,放置于 -80C (可存放至少 3個(gè)月) Capillarys Minicap 血紅蛋白條帶識(shí)別表Capillarys/Minicap區(qū)帶識(shí)別表Z

15、 15 : Hb HZ 14 : /Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore, J-KaoshiungZ 12 : Hb Barts, Hb Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore.Z 11 : Hb Kaoshiung(New York),denaturated Hb AZ 10 : Hb Hope, Hb M-IwateZ 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom PenhZ 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GAZ 7 : Hb F, dena

16、turated Hb S, Hb Porto-Allegre. Z 6 : Hb D-Punjab, Hb Philadelphia, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kln,denaturated Hb E.Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab.Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb Kln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variantsZ 3 : Hb A2, Hb O-ArabZ 2 : Hb C, Hb Constant

17、Spring, Setif HbA2 variantZ 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant正常Hb A2 質(zhì)控品條帶結(jié)果可錄為QC30Hb AFSC質(zhì)控品, 可用來(lái)作為參照曲線,便于異常結(jié)果的判斷31Hbs A, F,A2 檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)顏色進(jìn)行區(qū)分 異常區(qū)帶顯示為灰色32主要異常血紅蛋白變異體Z15 Hb HZ12 Hb BartZ10 Hb HopeZ9 Hb A Z7 Hb FZ6 Hb D PunjabZ5 Hb SZ4 Hb EZ3 Hb A2Z2 Hb CHbEHbSHbH HbS 變異

18、體, Hb A2 正常值 6 Glu ValHb A = 22Hb S = 2S2Hb A2 = 2234Capillarys/Minicap血紅蛋白試劑優(yōu)勢(shì):無(wú)需前處理(不需要洗血和溶血)，直接檢測(cè)血紅蛋白C和E能從A2分離開(kāi)根據(jù)S型和D型的細(xì)微電荷區(qū)別, 進(jìn)行區(qū)分. 對(duì)于處于A和S之間的F給予個(gè)性化和聚焦的精確量化.對(duì)A2型血紅蛋白有很好的分辨率和分離效果Hb Barts 和 Hb H可以很好的檢測(cè)和量化糖化型血紅蛋白電泳出現(xiàn)在主體峰內(nèi),不影響檢測(cè)結(jié)果異常結(jié)果分析36Case 2:31 Y Female, 血紅蛋白 12.8, 紅細(xì)胞壓積 37.4 (I)A = 84.1 %F = 1.5

19、%A2= 5.5%3731 Y Female, Hgb 12.8, Hematocrit 37.4 (II)AlkAcidFSCA2CSF-thalassemia- 輕型A2AAAACPCPA=93.4%, F=1.1%, A2=5.5%38Hb A 92.5%Hb A2 4.9%Hb FHb AHb A267 Y female from Tunisia, Hgb 9.1, hematocrit 28, MCV 62小紅細(xì)胞癥; beta thalassemia輕型Hb H 4%Hb A 94.7%Hb A2 1.3%Hb AHb A2Hb H嚴(yán)重小紅細(xì)胞癥; 血紅蛋白H病，需要基因篩查Hb

20、H and Barts - Alpha-thalassemia H Barts 41Case 1: 13 Y Male, Hgb 8.1, Hct 24.0 (I)A2= 6.1%S = 82.8 %42Case 1:13 Y Male, Hgb 8.1, Hematocrit 24.0 (II)AlkAcidFSCSA2 + FCSFS Hgb F/S, A2=4.6% + beta thalassemia minorA2AFACPCP43Case 2:65 Y Male, Hgb 9.4, Hematocrit 27.3 (I)Co-migration with A2A= 62.1 %A2

21、 = 31.7%*44Case 2: Hb E Migrates Separately From Hb A226 GluLys45Hb A 95%Hb F 2.1%Hb A2 2.9%Normal pattern, Hb F slightly increased (pregnancy)Hb F 49.5%Hb S 25.9%Hb A2 1.8%Hb C 22.8%Hb FHb SHb A2Hb CSC compound heterozygotyDiabetic patient, 54 Y, Hgb 14.5, hematocrit 43.5, MCV 88 HbA1c measurement

22、(HPLC Tosoh)Hb A 54.7%Hb X 41.7%Hb A2 3.6%Hb AHb A2Hb XNormal hemogram; compatible with heterozygote A/D;To be identified by genotypingHb A 51.8%Hb A2 2.9%Hb C 35.9%Hb AHb A2Hb CDiabetic patient, 61 Y, Hgb 11.6, hematocrit 34.8, MCV 85Slight anemia; compatible with heterozygote A/CTo be identified b

23、y genotyping Adopted child, 4 Y, originated from Haiti, Hgb 10.9, Hb A 97.5%Hb A2 1.4%Hb X 1.1%Hb AHb A2Hb XSlight anemia; heterozygous Delta mutation, asymptomaticAlpha chain mutation; genotyping confirmation:Hb Winnipeg a 75 Asp TyrHb A- WiHb A2-WiHb AHb A2Hb A 90.3%Hb F 3.8%Hb A2 5.9%Hb AHb FHb A

24、2Hb A 64%Hb S 33.1%Hb A2 2.9%Hb AHb SHb A2Hb A 2.2%Hb F 67.3%Hb S 29.1%Hb A2 1.4%Hb AHb FHb SHb A2Father: Beta thalassemia minor Mother: Heterozygote ASBaby 2 months old: Association S - beta thalassemiaHb Lepore on Minicap/CapillarysANAlc.A2LeporeNAc. A0 + LeporeA1Hb A2Hb AHb FHb LeporeAFSC control

25、 overlayingHb Leporeb和d鏈重新組合形成.在堿性緩沖液下電泳: 總體帶電荷下降 電泳位置出現(xiàn) 在S型血紅蛋白附近基因雜合體:Hb Lepore fraction: 5 15 %Clinical signs of minor b thalassemia基因純合體:Hb Lepore fraction: about 30 %Clinical signs of homozygous b thalassemia常見(jiàn)區(qū)域:Lepore (- Boston Washington): 常見(jiàn)于意大利人群; 同樣常見(jiàn)于在羅馬尼亞, 澳大利亞和墨西哥人群.特點(diǎn):a47 AspHisHb Has

26、haronHb AHb A2Hb FHb HasharonHb Ha-A2Hb O-Arabb121 GluLysHb A2+ O-ArabHb FHb ADIAGNOSTIC FLOW-CHARTA NEW FAST HEMOGLOBIN ELECTROPHORESIS METHOD FOR DRIED BLOOD SPOTS ON SEBIA CAPILLARYS AUTOMATED SYSTEM現(xiàn)有的新生兒血紅蛋白篩查方法 (SCD) 新生兒血紅蛋白檢測(cè): * 等電聚焦 (IEF) * 高效離子交換液相色譜法 (CE-HPLC). 毛細(xì)管電泳方法可取代常規(guī),操作復(fù)雜的等電聚焦方法新生兒血

27、紅蛋白快速檢測(cè)法取血板BSD600 全自動(dòng)打孔器 全自動(dòng)溶血, 樣品稀釋和檢測(cè)溶血?jiǎng)悠窏l碼識(shí)別：取血板條碼樣品稀釋杯條碼使用純凈水洗脫樣品與IEF方法比較, 毛細(xì)管方法優(yōu)勢(shì)對(duì)于常見(jiàn)異常血紅蛋白變異體有100區(qū)分能力 (Hb S, C, D, E)對(duì)其他非常見(jiàn)變異體有良好檢測(cè)能力對(duì)不同類型樣品擁有相同檢測(cè)能力：新生兒, 早產(chǎn)兒或者進(jìn)行過(guò)輸血患兒樣品全程檢測(cè)溯源性: 取血板和樣品稀釋杯使用條碼高效性(48個(gè)樣品/小時(shí)), 576樣品/天4小時(shí)人機(jī)分離操作, 最多可進(jìn)行3X192個(gè)樣品檢測(cè)可選擇使用與毛細(xì)管匹配的全自動(dòng)打孔機(jī), 完全自動(dòng)化處理樣品無(wú)需人工進(jìn)行樣品轉(zhuǎn)移, 避免交叉污染該項(xiàng)目檢測(cè)完全自

28、動(dòng)化: 從前處理到檢測(cè), 直到結(jié)果分析,全程無(wú)需人工干預(yù).使用標(biāo)準(zhǔn)取血板, 在室溫下進(jìn)行干燥.干燥的取血板可在 2-8C下,保存1個(gè)月.新生兒血紅蛋白檢測(cè)的樣品要求通過(guò)顏色區(qū)分正常及異常樣品正常血樣 :with Hb F and Hb A(+ acetylated Hb F)異常血樣提供樣品檢測(cè)完整溯源性通過(guò)樣品 ID, 試劑杯和全自動(dòng)打孔器的數(shù)據(jù)記錄完成數(shù)據(jù)交換異常樣品自動(dòng)顯示電泳圖譜說(shuō)明 : * 檢測(cè)到條帶的位置, 圖譜會(huì)自動(dòng)定位* 鼠標(biāo)經(jīng)過(guò)的區(qū)帶位置, 會(huì)顯示出該區(qū)帶的所有可能出現(xiàn)的異常血紅蛋白名稱. (N1 to N13). 新生兒血紅蛋白檢測(cè)條帶名稱識(shí)別表N 13 : Hb Bart

29、sN 12 : /N 11 : Hb Hope, Gamma chain variants, denatured Hb AN 10 : Hb AN 9 : Denatured Hb FN 8 : /N 7 : Hb FN 6 : /N 5 : Hb D-Punjab, Hb G-Philadelphia, Hb Korle-BuN 4 : Hb S, acetylated gamma chain variantsN 3 : Hb E, Hb F-Ouled Rabah, gamma chain variants, MethemoglobinN 2 : Hb A2, Hb O-Arab, Hb

30、F-Ouled Rabah, gamma chain variantsN 1 : Hb C正常血樣Hb FHb ABirth: 19/01/06Sample collection: 24/01/06Term : 39 w.Weight : 3445 g輸血后檢測(cè)結(jié)果Birth: 29/01/06Sample collection: 01/02/06Term : 38 w.Weight : 3100 gF/S homozygoteBirth: 05/01/06Sample collection: 08/01/06Term : 37 w.Weight : 3490 gHb SHb FDenatur

31、ed Hb F早產(chǎn)兒體內(nèi)的F/SDenatured Hb FHb FHb SBirth: 20/02/06Sample collection: 23/02/06Term : 34 w.Weight : 1300 g F/SC compound heterozygoteDenatured Hb FHb FHb SHb CBirth: 30/01/06Sample collection: 02/02/06Term : 40 w.Weight : 3900 gF/AS heterozygoteHb AHb FHb SBirth: 16/12/06Sample collection: 19/12/06

32、Term : 36 w.Weight : 2780gF/C homozygoteHb FHb CDenatured Hb FBirth: 20/12/05Sample collection: 24/12/05Term: 39 w.Weight: 3160 gF/AC heterozygoteBirth: 18/12/06Sample collection: 21/12/06Term: 40 w.Weight: 3035 gF/AC in a premature newbornBirth: 17/10/05Sample collection: 20/10/05Term: 30 w.Weight: 2330 g F/AD heterozygoteBirth: 29/01/06Sample collection: 31/01/06Term: 37 w.Weight: 3280 gF/E homozygoteHb E