重組人干擾素生產(chǎn)工藝課件

1、生物制藥工程主講教師： 劉 凱 liukai_山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系第七章 重組人干擾素生產(chǎn)工藝7.1 干擾素概述7.2 基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏7.3 重組人干擾素的發(fā)酵工藝過程7.4 重組人干擾素的分離純化工藝過程7.1.1 概述 細(xì)胞因子（cytokine）是指有機(jī)體細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽，可調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能，參與各種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和行使各種功能。 細(xì)胞因子在某些情況下還可產(chǎn)生病理作用，參與自身免疫病、腫瘤、移植排斥、休克等疾病的發(fā)生和發(fā)展。干擾素（interferon，IFN） 干擾素是最早發(fā)現(xiàn)、研究最多、第一個(gè)被克隆、第一個(gè)用于臨床治療疾病的細(xì)胞因子。

2、干擾素是機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。 在正常個(gè)體的脾臟、肝臟、腎臟、外周血淋巴細(xì)胞和骨髓中都可以檢出。干擾素的發(fā)現(xiàn)就像弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素一樣，干擾素的出現(xiàn)也充滿了神奇和偶然色彩， 50年代之前由病毒造成的傳染病大流行嚴(yán)重影響了人類的健康，僅1918年的一次全球爆發(fā)的流感大流行就造成了4千萬人的死亡，此外天花、麻疹、脊髓灰質(zhì)炎等病毒引起的傳染病也是非常流行，然而，人類一直沒有找到一個(gè)象對(duì)抗細(xì)菌感染一樣對(duì)抗病毒的有力武器，索性當(dāng)時(shí)免疫學(xué)的發(fā)展促成了人類疫苗的研制成功，通過疫苗人們成功的抵御住了天花、麻疹

3、、脊髓灰質(zhì)炎的侵襲，然而，對(duì)于流感病毒感染卻一直沒有取得很好的突破，由于流感病毒容易變種的原因，流感疫苗一直未能研發(fā)成功，但仍有很多科學(xué)家在不遺余力的進(jìn)行著流感病毒疫苗及其免疫接種等相關(guān)的研究。1918年流感病毒大爆發(fā)時(shí)場景 1957年，英國病毒生物學(xué)家Alick Isaacs和瑞士研究人員Jean Lindenmann，在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)了解到，病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種因子，后者作用于其他細(xì)胞，干擾(interfere)病毒的復(fù)制，故將其命名為干擾素(interferon)。 Alick Isaacs Jean Lindenmann1966-1971年，F(xiàn)riedman發(fā)

4、現(xiàn)了干擾素的抗病毒機(jī)制，引起了人們對(duì)干擾素抗病毒作用的關(guān)注，而后，干擾素的免疫調(diào)控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗腫瘤作用逐漸被人們認(rèn)識(shí)。1976年，Greenberg等首先報(bào)道用人白細(xì)胞干擾素治療4例慢性活動(dòng)性乙肝，治療后有2例HBsAg消失。但是由于人白細(xì)胞干擾素原材料來源有限，價(jià)格昂貴，因此未能大量應(yīng)用于臨床。 Robert M. Friedman 1980-1982年，科學(xué)家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干擾素，從每1 L細(xì)胞培養(yǎng)物中可以得到2040 ml干擾素。從1987年開始，用基因工程方法生產(chǎn)的干擾素進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)，并且大量投放市場。天然干擾素的分類與命名 根據(jù)國際

5、干擾素命名委員會(huì)的建議，天然IFN一般首先按動(dòng)物來源分類，例如人干擾素(HuIFN)，牛干擾素(BovIFN)等，然后再按IFN的抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)分成不同的型別，加以命名。 天然干擾素種類繁多，分子量也不同，亦有不同的抗原性。目前了解由人的不同細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素至少有三種不同的抗原成分：白細(xì)胞干擾素抗原(Le)、人成纖維細(xì)胞干擾素抗原（F）和T淋巴細(xì)胞干擾素抗原（T）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，將人細(xì)胞所產(chǎn)生的幾種干擾素，按其抗原性不同分為、和三類，Le干擾素即為-干擾素（IFN-），F(xiàn)干擾素為干擾素（IFN-）。T-干擾素即干擾素（IFN-）。 通過核酸內(nèi)切酶切割分析，從而搞清了其全部核苷酸的

6、順序，由此又推導(dǎo)出全部核苷酸順序，在、與三型干擾素中又因各型中又有氨基酸的順序不同，又可分為若干亞型。IFN-，由白細(xì)胞產(chǎn)生，有25種不同的亞型IFN-，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，4種亞型IFN-，活化的T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)產(chǎn)生，4種亞型根據(jù)對(duì)酸和熱穩(wěn)定性，將干擾素分為I型和II型：pH2.0，56，1h，有活性的為I型。 I型干擾素：IFN-、IFN-、IFN-、 IFN- 、IFN- II型干擾素：IFN-干擾素 IFN-基因表達(dá)產(chǎn)物為188189個(gè)氨基酸的前體，N端23個(gè)氨基酸殘基是親水信號(hào)肽，分泌出細(xì)胞時(shí)被切除，活性產(chǎn)物為165166個(gè)氨基酸。干擾素 IFN-和IFN- 具有許多

7、相似的生物學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)，核苷酸序列的同源性高達(dá)80，氨基酸水平的同源性約為25%30 。 天然人IFN-由166個(gè)氨基酸組成，分子量23kDa。 成熟IFN-有20糖基（第80位有一個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)）。 有3個(gè)半胱氨酸（Cys），其中第31位和141位Cys之間形成的二硫鍵，與分子的正確折疊和功能有關(guān)，對(duì)于其生物學(xué)活性非常重要。干擾素 IFN-雖然基因序列、氨基酸組成和來源與INF-和IFN-完全不同、但生物學(xué)活性有許多相似之處。 N端23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，在分泌出細(xì)胞時(shí)被切除，活性產(chǎn)物由143個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為16 kDa。 IFN-分子中沒有形成二硫鍵的半胱氨酸，其活性形式是

8、牢固的二聚體或四聚體，單體沒有活性。對(duì)酸不穩(wěn)定，不耐熱。分子中含有很多堿性氨基酸，等電點(diǎn)超過pH8.6。天然IFN-是一種糖蛋白，而大腸桿菌表達(dá)的IFN-無糖基化，仍有生物學(xué)活性。重組人干擾素的種類上市的重組人干擾素有重組人干擾素-、重組人干擾素-、重組人干擾素三類，共六種。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同將其分類命名，其中型包括1b、 2a、 2b，其中2b生物活性高，其與相應(yīng)受體的結(jié)合率強(qiáng)，抗體發(fā)生率低，是目前國際公認(rèn)療效最好、構(gòu)效比最佳的重組人干擾素-，臨床應(yīng)用最為廣泛。型包括1a、1b。臨床階段：IFN干擾素的理化性質(zhì)分子量1840kDa等電點(diǎn)5.78.5pH210范圍內(nèi)穩(wěn)定比病毒顆粒小對(duì)乙醚、氯仿

9、敏感容易吸附到玻璃等介質(zhì)上。7.1.2 IFN的生物學(xué)功能抗病毒（rhuIFN）抗腫瘤（rhuIFN）免疫調(diào)節(jié)（rhuIFN）多發(fā)性硬化癥（rhuIFN）是多種疾病的治療手段1、廣譜抗病毒活性病毒的復(fù)制可概括為吸附侵入脫殼生物合成裝配釋放。干擾素抗病毒的作用機(jī)制有：（1）抗病毒的作用過程（2）抑制病毒蛋白質(zhì)的合成（3）降解病毒mRNA干擾素抗病毒作用機(jī)理干擾素抗病毒作用的特點(diǎn)：（1）不能殺死病毒，僅僅是抑制作用；（2）對(duì)病毒沒有直接的作用，通過細(xì)胞核內(nèi)的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用，因此不同細(xì)胞對(duì)干擾素的敏感不同；（3）病毒大量復(fù)制時(shí)引發(fā)細(xì)胞炎癥應(yīng)答，此時(shí)干擾素易產(chǎn)生作用；（4）當(dāng)病毒DNA已整

10、合到宿主細(xì)胞的染色體中時(shí)，干擾素不能發(fā)揮其抗病毒活性。2、干擾素抗腫瘤作用機(jī)制腫瘤細(xì)胞：無限繁殖能力；轉(zhuǎn)化能力；滋潤能力。干擾素抗腫瘤作用機(jī)制：（1）直接抑制腫瘤細(xì)胞（2）調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)（3）改變宿主與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系3、干擾素的免疫調(diào)節(jié)活性免疫是機(jī)體識(shí)別和排除抗原異物，起維持機(jī)體的生理平衡和穩(wěn)定的功能。包括三部分：免疫監(jiān)視系統(tǒng)、免疫防衛(wèi)系統(tǒng)和免疫自穩(wěn)系統(tǒng)。在異常情況下，免疫會(huì)產(chǎn)生排斥性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成損傷。（1）對(duì)免疫監(jiān)視系統(tǒng)的調(diào)節(jié)：免疫監(jiān)視的作用是處理發(fā)生突變的自身細(xì)胞。干擾素能夠增強(qiáng)監(jiān)視效應(yīng)細(xì)胞對(duì)病變細(xì)胞的直接殺傷作用。（2）對(duì)免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)：免疫防衛(wèi)的作用是排斥和消滅侵入的外

11、源性物質(zhì)。干擾素對(duì)其中的體液免疫、細(xì)胞免疫和吞噬免疫均有調(diào)節(jié)作用。（3）對(duì)免疫自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)：免疫自穩(wěn)的作用是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)自身，排除免疫代謝過程中產(chǎn)生的廢物和損傷、死亡的淋巴細(xì)胞，即機(jī)體的自我調(diào)節(jié)、自我穩(wěn)定。免疫缺陷癥患者，產(chǎn)生免疫相關(guān)細(xì)胞的抗體，造成免疫系統(tǒng)的自我攻擊。干擾素抑制T淋巴細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，恢復(fù)細(xì)胞免疫功能。7.1.3 重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎直接抗腫瘤活性（rhuIFN）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kapos肉瘤、非霍金淋巴瘤免疫調(diào)節(jié)活性（rhuIFN）-治療慢性肉芽腫瘤多發(fā)性硬化癥-rhuIFN7.1.4 I

12、FN的副作用 流感樣癥狀是最為常見的癥狀，如畏寒、疲勞、厭食、頭痛、嘔吐、肌痛、腹瀉等。 以低劑量開始給藥可以避免過強(qiáng)的副反應(yīng)，或預(yù)先給解熱鎮(zhèn)痛藥可控制這一反應(yīng)，睡前服用也可減輕反應(yīng)。全身反應(yīng)在持續(xù)治療1至2周后可較好耐受。 長期、高劑量使用時(shí)可出現(xiàn)骨髓抑制、消化道反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)癥狀等，同時(shí)出現(xiàn)干擾素抗體。7.1.5 中國干擾素市場 我國是世界乙型肝炎高發(fā)國，目前有800萬1000萬名乙肝病人。這些病人卻很少選用干擾素作為治療藥物，主要原因就是干擾素過高的價(jià)格。 目前國內(nèi)重組人干擾素的市場呈現(xiàn)國產(chǎn)藥品和進(jìn)口藥品并存的格局。進(jìn)口重組人干擾素為長效干擾素，價(jià)格偏高，單價(jià)均在1000元左

13、右。國產(chǎn)重組人工干擾素為普通干擾素，最高劑量的單價(jià)只在100元左右。 目前干擾素的銷售量僅為國內(nèi)理論需求量的1%，理論上，我國干擾素市場應(yīng)有100億200億元人民幣的銷售額，如果今后干擾素真能降價(jià)到位，則其在國內(nèi)市場銷量還能提高1020倍。7.1.5 干擾素的生產(chǎn)工藝研究1.體外誘生干擾素制備工藝：仙臺(tái)（Sendai）病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年，IFN-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，1g IFN/3x105 L人血 白細(xì)胞來源困難，工藝復(fù)雜，收率低， 價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可 能性（特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒）。血漿人白細(xì)胞分離純化人白干擾素病毒誘導(dǎo)2.人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝1

14、975年，美國的斯爵德（Strander）等發(fā)現(xiàn)Namalva細(xì)胞（Burkitt淋巴瘤）具有高效的干擾素誘生能力。1999年，IFN-n1/Wellferon，批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，8m3反應(yīng)器。缺點(diǎn)：仍然需要病毒誘導(dǎo)；細(xì)胞系的改變，致使亞型干擾素的種類較前一工藝更多，活性低。退出臨床應(yīng)用。Namalva細(xì)胞培養(yǎng)合成干擾素分離純化多亞型混合干擾素病毒誘導(dǎo)3.基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；2001-2002：PEG化IFN，PEG

15、-Intron，Pegasys表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化，N-met（甲硫氨酸），無活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。優(yōu)點(diǎn)：來源上脫離了人血，并且純度和活性比人白干擾素有所提高，成本明顯降低。缺點(diǎn)：生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動(dòng)物或人血液提取成分，仍然沒有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險(xiǎn)。工程菌構(gòu)建發(fā)酵培養(yǎng)包涵體復(fù)性重組人 干擾素4.動(dòng)物無限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝CHO細(xì)胞即中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary），該細(xì)胞具有不死性，可以傳代百代以上，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞。 上市產(chǎn)品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，

16、Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166個(gè)氨基酸，糖基化蛋白，22.5kDa工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高，過程控制嚴(yán)格。可以做到無血清培養(yǎng)。工程CHO 細(xì)胞系構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化重組人干擾素5.基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida VG-84）上市產(chǎn)品IFN-2b/安福隆表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析制劑中采用非人血清白蛋白新型保護(hù)劑， 使得整個(gè)制造過程中不使用任何血液提取成分。7.2 基因工程假單胞桿菌的

17、構(gòu)建與保藏1、基因工程假單胞桿菌菌種建立2、基因工程假單胞桿菌菌種特性3、菌種庫的建立與保藏1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素基因的克隆（RT-PCR）制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR，目的基因連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選鑒定。測序：編碼人IFN-2b基因序列，501bp，編碼165個(gè)氨基酸第二步：表達(dá)載體構(gòu)建IFN基因與表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆獲得序列正確表達(dá)載體第三步：工程菌構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿菌篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種2、基

18、因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特性細(xì)菌：G-，可運(yùn)動(dòng)，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.53.0 mm（LB，30，24h），灰綠色半透明，粘稠。生化特性： （1）蘇氨酸營養(yǎng)缺陷，可以利用L-纈氨酸、D/L-精氨酸和L-蘇氨酸作為碳源 （2）工程菌的特征：鏈霉素抗性、四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性。 （3）具有生產(chǎn)干擾素能力：不低于2.0 x109 IU/L3、菌種庫的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)加入甘油，冷凍保藏原始菌主菌種庫工作菌種庫傳代擴(kuò)增，冷凍保藏7.3 重組人干擾素的發(fā)酵工藝過程工作菌種庫搖瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體收集采用適宜的不含任何

19、抗生素的培養(yǎng)基，定期進(jìn)行質(zhì)粒丟失率檢查 。 1、搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化；搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250rpm，1620h；檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查2、種子罐培養(yǎng)接種：接入50L種子罐，接種量10%培養(yǎng)：30，pH7.0控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 DO為30%，34h，OD4.0檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌3、發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)的發(fā)酵罐，接種量10%控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速前4h：30，pH7.0，DO為30%4h后：20，pH6.0，DO為60%，56.5h終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.01.0，5冷水快速降溫至15以下（減緩細(xì)胞衰老）檢測

20、：發(fā)酵液雜菌檢查4、菌體收集連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000rpm離心收集菌體保存：-20冰柜，不超過12個(gè)月檢測：重組人干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等。5、發(fā)酵工藝控制（1）發(fā)酵中菌體生長與干擾素合成基本處于不相關(guān)狀態(tài)。菌體在培養(yǎng)1.5h后分裂速度最快，到3.5h開始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5h之后，在4h達(dá)到最大。然后由于降解而迅速下降。（2）培養(yǎng)基組成：種子培養(yǎng)基C/N低，發(fā)酵培養(yǎng)基C/N高；假單胞桿菌在以水解酪蛋白、酵母粉等組成的營養(yǎng)豐富的合成培養(yǎng)基中生長較好，顯示出較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性；K2HPO4/KH2PO4緩沖液。（3）溶解氧：

21、15%可滿足生長，但70%以上才能保證產(chǎn)品大量合成（是15%的6倍）。兩段培養(yǎng)策略。（4）溫度：20有效防止干擾素-2b的降解；最佳生長溫度為30 ；質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度升高而迅速下降。（5）pH：兩段培養(yǎng)；干擾素-的等電點(diǎn)在pH6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受pH2.5的酸性環(huán)境，因而可在發(fā)酵后期降低pH，從而造成大量蛋白酶失活，減少干擾素-的水解，提高干擾素的積累量。（6）發(fā)酵過程中泡沫形成與控制：機(jī)械攪拌和加入少量表面活性劑7.4 重組人干擾素的分離純化工藝過程7.4.1 干擾素分離工藝過程7.4.2 干擾素的純化工藝過程干擾素分離純化過程的主要問題是保持干擾素的活性。蛋白質(zhì)失活的機(jī)

22、理：一級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)的變化，造成失活（肽鍵的酸水解、Cys、Trp、Met的氧化、二硫鍵被還原、巰基與金屬離子作用，形成硫醇鹽、Asn和Gln脫酰胺作用、氨基酸的消旋作用、Pro的異構(gòu)化）；三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致失活（聚集、酶失去輔酶、寡聚蛋白質(zhì)解離成單體、吸附于容器表面、不正確的折疊、形成錯(cuò)配的二硫鍵等）。蛋白質(zhì)失活的原因：溫度、流體狀態(tài)、摩擦、剪切力、吸附、截流、pH和介質(zhì)條件、溶液中氣體、微生物、活性抑制劑等。原料菌體裂解沉淀離心鹽析離心 冰箱保存 粗干擾素溶解沉淀離心 疏水色譜沉淀超濾透析 陰離子交換色譜超濾透析 陽離子交換色譜超濾凝膠過濾色譜 無菌過濾分裝加塞壓瓶入庫

23、緩沖液配制7.4.1 干擾素分離工藝過程（1）菌體裂解（2）預(yù)處理（3）初級(jí)分離（1）菌體裂解裂解緩沖液：純化水配置，210（pH7.5）使用保護(hù)劑：DTDE（硫二乙醇）、EDTA（乙二胺四乙酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）將-20冷凍的菌體破碎成2cm以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液， 210，攪拌2h凍融：細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。（2）預(yù)處理加絮凝劑聚乙烯亞胺： 210，氣動(dòng)攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液： 210，氣動(dòng)攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。離心：連續(xù)流離心機(jī)： 210，16000rpm收集上清液：含有重組人干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121、30mi

24、n蒸汽滅菌，焚燒處理。（3）初級(jí)分離鹽析：4 mol/L硫酸銨， 210，攪勻靜置過夜離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000rpm保存：收集沉淀，粗干擾素，4（不得超過3個(gè)月）分離工藝的控制要點(diǎn)（1）使用保護(hù)劑干擾素中的巰基極易被氧化成二硫鍵，所以必須使用巰基試劑如硫乙二醇（DTDE）加以保護(hù)；金屬離子是酶的激活劑和輔助因子，加入金屬螯合劑EDTA可除去金屬離子，從而抑制酶的活性；PMSF是絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶的抑制劑，加入后保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物以免被水解。（2）使用絮凝劑加入聚乙烯亞胺產(chǎn)生絮凝作用。影響因素：絮凝劑種類、用量、溶液pH、攪拌速度和時(shí)間等。濃度不易過高，否則會(huì)吸附飽和，在膠粒表面形成覆蓋層

25、而失去與其他膠粒架橋的作用，影響絮凝效果，同時(shí)會(huì)包裹一些目標(biāo)產(chǎn)物，造成損失。過高剪切力會(huì)打碎絮團(tuán)，因此適當(dāng)?shù)臄嚢钑r(shí)間和速度可以提高絮凝效果。加入時(shí)注意不要使溶液局部絮凝劑的濃度過高，否則會(huì)削弱沉淀作用。（3）使用凝聚劑加入醋酸鈣產(chǎn)生凝聚作用。菌體及其碎片大多帶負(fù)電，由于靜電引力作用將溶液中的帶正電的粒子吸附在周圍，形成雙電層的結(jié)構(gòu)，水化作用是膠體穩(wěn)定存在的一個(gè)重要原因。加入醋酸鈣的作用是破壞雙電層和水化層，使粒子間的靜電排斥力不足以抵抗范德華力而聚集起來。7.4.2 干擾素純化工藝過程（1）溶解粗干擾素（2）沉淀與疏水層析（3）陰離子交換層析與濃縮（4）陽離子交換層析與濃縮（5）凝膠過濾層析（

26、6）無菌過濾分裝（1）溶解粗干擾素配置純化緩沖液 超純水配置，pH7.5磷酸緩沖液，0.45m濾器和10 kDa超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至210。檢查：緩沖液的pH值和電導(dǎo)值溶解： 210，勻漿，粗干擾素完全溶解（2）沉淀與疏水層析等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：用NaOH調(diào)節(jié)上清液pH7.0，并用5 mol/L NaCl調(diào)節(jié)溶液電導(dǎo)值180mS/cm，上樣，利用干擾素的疏水性進(jìn)行吸附。洗脫與收集：210下，用0.025mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）+1.6mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，除去非疏水性蛋白，然后用0.01mol/L磷酸緩沖液

27、（pH8.0）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)至pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40 mS/cm， 210，靜置過夜（12h）。超濾：1000 kDa超濾，除去大蛋白，收集濾液透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導(dǎo)值5.0 mS/cm，10kDa超濾膜， 210，0.005mol/L緩沖液透析。（3）陰離子交換層析與濃縮0.01mol/L磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。上樣后，用相同緩沖液沖洗，采用鹽濃度線性梯度550 mS/cm進(jìn)行洗脫。配合SDS收集干擾素峰濃縮：合并陰離子交換色譜洗脫的有效部分，調(diào)整溶液pH5.0、電導(dǎo)5.0mS/cm，10kDa超濾膜，210，0.005mol/L醋

28、酸緩沖液（pH5.0）透析。（4）陽離子交換層析與濃縮用0.1mol/L醋酸緩沖液（ph5.0）平衡樹脂。上樣后，用相同緩沖液沖洗，在210下，采用鹽濃度線性梯度550 mS/cm進(jìn)行洗脫。配合SDS收集干擾素峰濃縮：合并陽離子交換色譜洗脫的有效部分，在210下，用10kDa超濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮到1L。（5）凝膠過濾層析洗滌液：含有0.15mol/L NaCl的0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂。上樣后，在2-10下，用相同緩沖液進(jìn)行洗脫。合并干擾素部分，最終蛋白濃度應(yīng)為0.10.2 mg/ml（6）無菌過濾分裝0.22 m濾膜過濾干擾素溶液分裝-20以下的冰箱中保存（7）檢測項(xiàng)目干擾素鑒別試驗(yàn)干擾素效價(jià)測定蛋白質(zhì)含量測定、電泳純度測定、HPLC純度測定、分子量宿主殘余蛋白檢查