課題3　血紅蛋白的提取和分離

1、課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）教學(xué)目標(biāo)教學(xué)重點(diǎn)教學(xué)難點(diǎn)理解色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理了解緩沖液的組成及其作用 血紅蛋白的分離樣品處理凝膠色譜法的原理電泳法分離大分子的原理課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）一、基礎(chǔ)知識(shí)蛋白質(zhì)提取和分離原理 蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。 提取分離方法凝膠色譜法 凝膠電泳法 課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）1.凝膠色譜法 （1）原理：（2）材料大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

2、 課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）1.凝膠色譜法 （3）分離過程 混合物上 柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收 集大分子收 集小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液， 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。 課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等1.凝膠色譜法 （4）緩沖溶液洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）2凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用

3、力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素課題3 血紅蛋白的提取與分離（I）在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 2凝膠電泳法：（2）分離方法：（3）分離過程： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）二、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理粗 分 離純 化純度鑒定 血液組成成分 1.洗 滌 紅 細(xì) 胞 2.釋放血紅蛋白 3.分離血紅蛋白 4.透析血紅蛋白血液組成成分閱讀思考：血液由_和_兩部分組成。血細(xì)胞中_細(xì)胞數(shù)量最多

4、，細(xì)胞的含量最高的化合物是_。該化合物是由 _和_構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的_基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條-肽鏈2條-肽鏈 亞鐵血紅素課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）1.洗 滌 紅 細(xì) 胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2 min紅細(xì)胞血 漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢?/p>

5、的目的是_。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min 離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）粗分離凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5193.樣品的加入和洗脫材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12

6、h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒洗脫液沸水浴 凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）3.樣品的加入和洗脫課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）注意事項(xiàng)1. 紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2. 凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3. 色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4. 色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。為什么？課題3 血紅蛋白的提取與分離（II）知識(shí)總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原 理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組 成作 用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗