流式免疫染色

1、流式免疫染色（一）免疫熒光染色免疫熒光染色是進(jìn)行免疫標(biāo)志分析的關(guān)鍵步驟，主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接免疫熒光染色是采用特異的無(wú)熒光標(biāo)記的一抗與待測(cè)標(biāo)本反應(yīng)，經(jīng)溶血、洗滌后，加入標(biāo)記熒光 的一抗抗體，經(jīng)過(guò)孵育、洗滌后上機(jī)檢測(cè)。在應(yīng)用FCM的初期，由于標(biāo)記熒光抗體的單抗較少，多采用間 接免疫熒光標(biāo)記方法。而隨著抗體的發(fā)展，目前標(biāo)記熒光的抗體越來(lái)越多，因此不必再采用此方法了。而 間接標(biāo)記的方法難以進(jìn)行多色的標(biāo)記，這是該方法的另一個(gè)主要缺點(diǎn)。再加上操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、信噪比高， 因此目前基本不再應(yīng)用了。但是，在科研中需要研究一些新的抗原，而這些抗原可能無(wú)直接標(biāo)記熒光的抗 體，此時(shí)只能采用此

2、方法。直接免疫熒光染色是在標(biāo)記時(shí)加入連接著熒光素的特異抗體，該方法具有操作簡(jiǎn)單、背景熒光低、信 噪比低、可同時(shí)標(biāo)記多色抗體等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用各實(shí)驗(yàn)室。按照同時(shí)加入連接著標(biāo)記熒光素抗體的數(shù)目不同，直接免疫熒光染色法可分為單色和多色免疫熒光染 色法。1單色免疫熒光染色法在每一管待測(cè)的標(biāo)本中加入一種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體與待測(cè)標(biāo)本反應(yīng)，經(jīng)溶血、洗滌、固定后進(jìn) 入流式細(xì)胞儀檢測(cè)，省去了加二抗的步驟。因單色標(biāo)記法每管只能檢測(cè)一個(gè)抗原，難以在混合的細(xì)胞群體 中檢測(cè)特異細(xì)胞的抗原表達(dá)，往往不能滿足目前的臨床檢測(cè)需要，應(yīng)用較少。2多色免疫熒光染色法用2種、3種、4種或者4種以上單克隆抗體分別標(biāo)記不同熒光

3、素（經(jīng)不同的熒光檢測(cè)通道），同時(shí) 與待測(cè)細(xì)胞反應(yīng)，經(jīng)溶血、洗滌、固定后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每管可同時(shí)檢測(cè)多種抗原的表達(dá)。目前應(yīng) 用較廣的是三色（FITC、PE和Percp）和四色（FITC、PE、Percp和APC）免疫熒光標(biāo)記法。隨著多激光管 流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)、標(biāo)記單克隆的熒光素種類的增加，4色（6色、9色、17色等）以上免疫熒光標(biāo)記逐漸 應(yīng)用于科研和臨床檢測(cè)，為精確地界定不同類型的細(xì)胞提供了可靠的保障，而且可以同時(shí)觀察多種抗原間 的表達(dá)關(guān)系，大大減少了重復(fù)抗體的使用，有效節(jié)約了抗體和標(biāo)本用量。更重要的是可以提供更多的信息。 但4色以上免疫熒光標(biāo)記對(duì)儀器的要求更嚴(yán)格，同時(shí)補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)更為復(fù)雜，

4、目前應(yīng)用還未普及。根據(jù)標(biāo)記抗原部分的不同，可分為細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原染色，標(biāo)記的方法有差別，后者需要固定、 破膜等步驟，下面以4色免疫熒光標(biāo)記為例，著重介紹細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞內(nèi)抗原染色的步驟。（1）細(xì)胞表面抗原標(biāo)記細(xì)胞表面分子主要是從細(xì)胞內(nèi)合成后表達(dá)在細(xì)胞膜表面，各種細(xì)胞表面抗原或受體的流式細(xì)胞表型在臨床中應(yīng)用最廣泛，標(biāo)記和檢測(cè)也相對(duì)簡(jiǎn)單。1）分別加入四種熒光素FITC、PE、PerCP和APC標(biāo)記的單克隆抗體，不同試劑生產(chǎn)生產(chǎn)的抗體依據(jù)說(shuō)明書(shū)和細(xì)胞總數(shù)來(lái)確定抗體用量。以BD公司的抗體為例，以1X10e6細(xì)胞，F(xiàn)TIC、PE和PerCP 標(biāo)記的抗體用量一般分別為20ul，APC標(biāo)記的抗體用量為

5、5ul。2）標(biāo)記：按照上述標(biāo)本準(zhǔn)備方法，加入適量50-100ul的抗凝骨髓（或其他類型）標(biāo)本，充分混勻后室溫避光孵育15min。3） 溶血：加入1XFACS溶血素2ml，低速渦流混勻，室溫避光靜置8-10min；如標(biāo)本量較大，紅細(xì)胞較多，需多加入1ml溶血素。溶血后以300g離心5min。4）洗滌：棄去上清，加入1ml含有0.1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，以300g離心洗滌5min。5） 上機(jī)檢測(cè)：棄去上清后加入PBS200-500ul （依細(xì)胞濃度而定），上機(jī)檢測(cè)。如不能就是上機(jī)檢測(cè)，則加入同樣體積的1%多聚甲醛，混勻后置于4冰箱內(nèi)保存，一般不超過(guò)24h。另外，部分特殊要求的

6、標(biāo)本需要不同的方法。例如為了避免FC受體的非特異性結(jié)合，在標(biāo)記Kappa 和lambda抗體石，要先用無(wú)血清PBS洗滌待測(cè)標(biāo)本3次，離心后再標(biāo)記、溶血、洗滌和上機(jī)檢測(cè)。（2）細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)抗原標(biāo)記除表達(dá)在細(xì)胞表面的分子外，細(xì)胞內(nèi)還存在大量分子或待分泌的細(xì)胞因子等，它們發(fā)揮著重要的生 理作用。了解細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)抗原、細(xì)胞因子的表達(dá)情況，對(duì)臨床疾病的診斷、預(yù)后判斷及發(fā)病機(jī)制的研究 等均有重大意義。但是，與細(xì)胞膜表面抗原標(biāo)記相比，細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)抗原的標(biāo)記首先需要透膜處理，而透 膜是否合適直接影響胞內(nèi)抗原的標(biāo)記，因此在檢測(cè)時(shí)要特別小心。隨著流式分析技術(shù)的不斷發(fā)展，目前細(xì) 胞內(nèi)或核內(nèi)抗原的應(yīng)用正逐漸增多。下面

7、將簡(jiǎn)述在血液學(xué)主要涉及的三種最常用且具有代表性的抗原標(biāo)記 方法：細(xì)胞內(nèi)和核內(nèi)抗原分析、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定。在血液系統(tǒng)疾病的診斷中，常需要鑒別診斷細(xì)胞的系列特性。而一些系列特異性標(biāo)志首先出現(xiàn)于細(xì)胞 內(nèi)或核內(nèi)。例如髓系標(biāo)志物髓過(guò)氧化物酶（MPO）、B淋巴細(xì)胞抗原標(biāo)志物、T淋巴細(xì)胞抗原標(biāo)記物、未成 熟細(xì)胞抗原標(biāo)志物、B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的抗原標(biāo)志物等，對(duì)于診斷不同類型的白血病和淋巴瘤具有重要 的臨床價(jià)值。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)抗原時(shí)通常需要同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞膜表面抗原，與單純標(biāo)記膜表面抗原的主要區(qū)別是首 先標(biāo)記膜抗原，然后在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)抗原前對(duì)細(xì)胞膜和核膜進(jìn)行透膜和固定，即在細(xì)胞膜和核膜上打 孔，以便讓熒光素標(biāo)記的抗體自有通過(guò)細(xì)胞膜和核膜，同時(shí)又不能破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，并盡量保持靶抗原的生物抗原性和細(xì)胞的散射光特點(diǎn)。對(duì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)，透膜是關(guān)鍵的步驟。如果透膜不完全，可能造成假陰性。 而透膜不好，則改變CD45和SSC特性。文獻(xiàn)報(bào)道某些胞內(nèi)抗原需要不同的透膜劑。因此在進(jìn)行胞內(nèi)抗原的 檢測(cè)前應(yīng)該進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以選擇合適的透膜劑。另外在觀察結(jié)果時(shí)可以在標(biāo)本中殘留的正常細(xì)胞作為內(nèi)對(duì) 照。例如檢測(cè)MP。時(shí)，正常粒細(xì)胞應(yīng)該為陽(yáng)性。檢測(cè)Ccd3時(shí)，正常T細(xì)胞應(yīng)為陽(yáng)性。而這些正常細(xì)胞如果 為陰性，說(shuō)明本次檢測(cè)檢測(cè)的結(jié)果不可靠。應(yīng)分析失敗的原因是什么，是試劑