酶的生產(chǎn)培訓(xùn)知識

1、Enzyme Engineering酶工程第三章 酶的生產(chǎn)制備 酶的生產(chǎn)方式1.提取法: 植物、動物、微生物2.化學(xué)合成法生物合成法： 利用植物、動物、微生物細胞合成。 上個世紀50年代起利用微生物生產(chǎn)酶。 1949年細菌發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶 上個世紀70年代以來利用植物細胞和動物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)酶。 木瓜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶 人黑色素瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)血纖維蛋白溶酶原激活劑動植物細胞培養(yǎng)的特殊性： 1、細胞比微生物細胞大得多，體積大幾千倍，2、對剪切力敏感，動物細胞沒有細胞壁更甚3、生長速率比微生物低，生長倍增時間和發(fā)酵周期均更長，4、對營養(yǎng)的要求較微生物復(fù)雜，動物細胞往往需要添加血

2、清和其他營養(yǎng)成分3、酶的發(fā)酵生產(chǎn)經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作控制，利用細胞的生命活動，產(chǎn)生人們所需要的酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。 第一節(jié) 酶的生產(chǎn)菌種一、生產(chǎn)菌種1.細菌 芽孢桿菌（蠟狀、枯草、地衣）、大腸桿菌2.霉菌 黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌 啤酒酵母、假絲酵母4.放線菌 鏈霉菌二、產(chǎn)酶菌種的要求（1）不是致病菌及產(chǎn)生有毒物質(zhì)或其他生理活生物質(zhì)的微生物，確保酶生產(chǎn)和應(yīng)用的安全。 （2）能在便宜的底物上生長良好，繁殖快，產(chǎn)酶量高，有利于縮短生周期（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。（4）目標酶的產(chǎn)量要高，性能符合應(yīng)用需要，產(chǎn)生的酶容易分離純化，最好為胞外酶。（5）除蛋白酶

3、生產(chǎn)菌種外，其他產(chǎn)酶菌種的產(chǎn)蛋白酶活力應(yīng)該很低，防止目標酶的水解。 三. 產(chǎn)酶微生物的分離和篩選 1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品 2)富集培養(yǎng): 投其所好，取其所抗 3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pure culture）。 4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。 -淀粉酶的篩選蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基第二節(jié) 酶的發(fā)酵技術(shù)一、培養(yǎng)基 C/N: 產(chǎn)酶促進劑: 誘導(dǎo)物 表面活性劑二、發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響 溫度、pH值、通風量三、發(fā)酵方法1、固體培養(yǎng)發(fā)酵：培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料加入其它營養(yǎng)成分，經(jīng)滅菌、接產(chǎn)酶菌株

4、，在一定條件下發(fā)酵，目的獲得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生產(chǎn)。 2、液體深層發(fā)酵液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵容器中，經(jīng)滅菌、冷卻接入產(chǎn)酶細胞，在一定條件下發(fā)酵，是目前酶生產(chǎn)的主要方法。 3、固定化細胞發(fā)酵第三節(jié) 提高酶產(chǎn)量的方法一、酶合成的調(diào)節(jié)機制1.操縱子調(diào)節(jié)基因： 阻遏蛋白 輔阻遏物2、誘導(dǎo)和阻遏誘導(dǎo)： 誘導(dǎo)物的加入后，酶才大量合成， 參與分解代謝的酶：淀粉酶、纖維素酶阻遏： 末端代謝物阻遏： 反饋阻遏，合成代謝中的關(guān)鍵酶 分解代謝物阻遏： 1. 酶合成的誘導(dǎo)加進某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進行。 酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實

5、驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白（有活性）基 因 關(guān) 閉啟動子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白（無活性） 基 因 表達mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)B、乳糖酶的誘導(dǎo) 乳糖 阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo) 2.末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現(xiàn)象： 實驗： （1）大腸桿菌生長在無

6、機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時， 檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟原則:不需要就不合成。 色氨酸操縱子酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化,與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白(

7、有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達代謝產(chǎn)物3.分解代謝物阻遏指細胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實驗：細菌在含有葡

8、萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”(diauxie或biphasic growth）。 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基 因 表達CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位 RNA聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5-AMP抑制激活葡萄糖降解物與c

9、AMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)三、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?選育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋阻遏 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種 二、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?選育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋阻遏 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分

10、解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種 （二）.通過條件控制提高酶產(chǎn)量（1）添加誘導(dǎo)物 選擇適宜的誘導(dǎo)物及濃度:誘導(dǎo)物： 酶的作用底物 酶作用底物的前體 酶的反應(yīng)產(chǎn)物 酶的底物類似物或底物修飾物等 IPTG/乳糖 纖維素/纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶 （2）降低阻遏物濃度 避免使用過于豐富的培養(yǎng)基和易被利用的碳源，并設(shè)法阻止效應(yīng)物的形成和濃度的增加。 流加和連續(xù)培養(yǎng)（3）.其他 促進分泌：添加表面活性劑 離子型 對細胞有毒害作用 表面活性劑 Tween80 非離子型 TritonX100 非離子型增加細胞通性， 添加產(chǎn)酶促進劑 植酸鈣鎂，聚乙烯醇等第四節(jié) 酶發(fā)酵動力學(xué) 細胞生長速度

11、產(chǎn)物生成速度 基質(zhì)消耗速度 環(huán)境因素的影響細胞生長動力學(xué)發(fā)酵產(chǎn)酶動力學(xué)發(fā)酵動力學(xué)研究內(nèi)容：一、酶生物合成的模式微生物細胞的生長歷程按細胞生長和酶產(chǎn)生的關(guān)系，酶生物合成具有下列四種模式：1、同步合成型2、延續(xù)合成型3、中期合成型4、滯后合成型1. 生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型） 酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。 當去除誘導(dǎo)物、細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。2.生長偶聯(lián)型中的特殊形式中期合成型 酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產(chǎn)物的反饋

12、阻遏或分解代謝物阻遏。 所對應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 3.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型） 酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。 所對應(yīng)的mRNA相當穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線4. 非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型） 只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。 所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的穩(wěn)定性2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在mR

13、NA的穩(wěn)定性，培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物，反饋阻遏物，分解代謝物的存在是影響酶生物合成模型的主要因素。 mRNA穩(wěn)定性 代謝調(diào)節(jié) 產(chǎn)物生成模型同步合成型 (-) 誘導(dǎo) dP/dt=dX/dt 延續(xù)合成型 (+) 誘導(dǎo) dP/dt=dX/dtX中期合成型 (-) 反饋阻遏 dP/dt=dX/dt （解除阻遏后）滯后合成型 (+) 分解代謝物阻遏 dP/dt=X 酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型（部分偶聯(lián)）：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。 對于：同步合成型：提高對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵 溫度 。滯后合成型：盡

14、量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方 面努力。目的：提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期最理想的合成模式：延續(xù)合成型策略措施：菌種選育：提高mRNA的穩(wěn)定性，解除分解代謝物阻遏和反饋阻遏。發(fā)酵代謝調(diào)節(jié)：理想誘導(dǎo)物的添加，解除反饋阻遏和分解代謝物阻遏（難利用的碳氮源的使用，補料發(fā)酵）。降低產(chǎn)酶溫度。二、細胞生長動力學(xué)微生物細胞生長的動力學(xué)方程：Monod方程：S限制性基質(zhì)濃度；m最大比生長速率；Ks Monod常數(shù)倒數(shù)形式：三、產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué)方程：X細胞濃度，以每升發(fā)酵液所含的干細胞重量表示（gDC/L）固定化微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶一、固定

15、化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點1、提高產(chǎn)酶率2、可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間3、基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失4、發(fā)酵穩(wěn)定性好5、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率6、產(chǎn)品容易分離純化7、適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)第三章 酶的生產(chǎn)和制備 第五節(jié) 酶的分離純化（酶的制備） 酶的提取和分離純化： 將酶從細胞或培養(yǎng)基中抽提出來，獲得與使用目的相適應(yīng)的有一定純度和濃度的酶產(chǎn)品的過程。兩個基本環(huán)節(jié)：分離和純化 分離：將酶從原料中抽提出來，并盡可能少引入雜質(zhì)，得到粗酶液 純化：將酶和雜質(zhì)中分離開來，或者有選擇地將酶從包含雜質(zhì)中分離出來，得到一定純度的酶。酶的純化過程與一般蛋白質(zhì)純化過程相比的特點： 1、特定的一種酶在

16、細胞中的含量較少， 2、酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤。 前者給純化帶來了困難，而后者卻迅速找出純化過程的關(guān)鍵所在。 理想的提取和分離純化方法：在提高酶的比活的同時，要求酶回收率高，提取步驟少、工藝簡單，成本低一、原則1.防止酶失活 這一原則要貫穿純化工作的始終，在后期尤為重要。 建立一個可靠和快速、易行的測定酶活方法 物理因素、化學(xué)因素和生物因素導(dǎo)致酶失活2.分離純化的環(huán)節(jié)的選擇（經(jīng)濟、宜行）： 純化倍數(shù)、酶活回收率和重現(xiàn)性 （衡量優(yōu)劣） 經(jīng)濟、可靠，建立靈敏、快速、特異、精確的檢測（酶活和蛋白質(zhì)的含量）手段。3、分離步驟、方法和成本間的關(guān)系 提取、分離、純化、制劑策略：酶產(chǎn)品的質(zhì)量要求設(shè)

17、定目標：（用途：醫(yī)用、食品級、工業(yè)級或研究級） 目標酶蛋白與主要雜質(zhì)的性質(zhì)提取過程的設(shè)計應(yīng)盡可能防止酶的損失，減少處理步驟。提取方法的經(jīng)濟性和可分析性 盡量減少添加劑的使用 盡早使用高效分離方法，將昂貴、費時的分離方法放在最后階段。 酶活力、蛋白濃度、純度測定方法可行性劑型（液體濃縮酶、粉狀酶、精制酶、結(jié)晶酶等）二、 酶活力（一） 酶活力 酶活力activity： 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。用酶催化的反應(yīng)速度來表示酶活力，即用單位時間內(nèi)，單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物增加量來表示。 轉(zhuǎn)換頻率：單位時間轉(zhuǎn)化的底物分子數(shù)。 Kcat,單位1/s（二）酶活力單位及比活力 酶活力單位U（active u

18、nit）：是根據(jù)某種酶在最適條件下，單位時間內(nèi)被酶作用的底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來規(guī)定的，表示酶活力高低。 IU：umol/min Kat：mol/s 1 Kat=6107 IU 酶的比活力 指每mg酶蛋白（或每mg蛋白氨）所含的酶活力單位數(shù)即：比活力=活力單位數(shù)/酶蛋白（氮）mg 表示酶制劑的純度，比活力愈高，酶愈純。一、基本過程（一）、材料（選擇）預(yù)處理及破碎細胞 1.胞內(nèi)酶和胞外酶 2.破碎細胞（二）、固液分離（離心或過濾） 酶的溶解性、穩(wěn)定性第六節(jié) 酶分離純化的基本過程（三）、凈化與脫色 絮凝劑 脫色處理（四）、濃縮 （熱量法、沉淀分離、膜分離） （五）純化、結(jié)晶 （干燥）二、酶分離純化方法三、酶分離純化中的一些數(shù)據(jù)（p93） 1.總蛋白 2.總活力 3.比活力 4.酶濃度 5.純化倍