細胞工程第三章細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)課件

1、第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)細胞工程是以離體細胞和組織的無菌操作為基礎(chǔ)的實驗性學科，它需要在模擬動植物細胞生長發(fā)育而設置的實驗條件和環(huán)境下進行一系列操作的。為此需要各種實驗設施設備適宜的培養(yǎng)條件與技術(shù)。本章重點介紹細胞工程實驗室的設置主要儀器設備以及細胞工程的基本實驗操作技術(shù)，這些是從事細胞工程工作的基礎(chǔ)。第一節(jié) 實驗室設置第二節(jié) 實驗室主要儀器設備第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇第五節(jié) 培養(yǎng)條件的選擇知識目標：了解細胞工程的通用技術(shù)熟悉實驗室設置、儀器設備、器具以其處理方法掌握培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件的控制掌握滅菌以及無菌

2、操作的原理與操作方法能力目標：掌握洗滌、滅菌和無菌操作技術(shù)（詳見實訓部分）會配制培養(yǎng)基（詳見實訓部分第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第一節(jié) 實驗室設置一、洗滌室二、滅菌室三、配制室四、無菌操作室(接種室)五、培養(yǎng)室 六、鑒定室七、馴化移植室第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第一節(jié) 實驗室設置一、洗滌室 用途：洗滌室主要用于玻璃器皿用具和培養(yǎng)材料清洗 配置:洗滌水槽、落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器二、滅菌室用途：用于培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌。配置:配備實驗臺高壓滅菌鍋排風滅火設備細菌過濾設備干熱消毒柜電爐等。 要求：設備的安裝和排列要合理房間要寬敞明亮

3、通風條件好，地面要便于清潔防滑。 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第一節(jié) 實驗室設置三、配制室用途：配制室主要用于配置培養(yǎng)基。配置:：冰箱天平微波爐pH計培養(yǎng)基分裝器藥品柜器械柜抽氣泵電爐各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶和用具培養(yǎng)皿移液管燒杯量筒容量瓶儲藏瓶等。冰箱用于儲存培養(yǎng)基母液激素維生素等貴重藥品彩色膠卷及保存植物材料。天平應有不同感量。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第一節(jié) 實驗室設置四、無菌操作室(接種室)用途：主要用于實驗材料的接種操作配置:超凈工作臺或接種箱、固定式載物臺、移動式載物臺、廣口瓶、酒精燈、紗布、器械支架、手術(shù)剪、解剖刀、解剖針、鑷子等。要求：無菌操作室在工作方便的前提下，宜

4、小不宜大，宜精細密閉，忌粗陋放散，是植物組織培養(yǎng)研究或生產(chǎn)工作中最關(guān)鍵的部分，關(guān)系到培養(yǎng)物的污染率，接種工作效率等重要指標。 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)五、培養(yǎng)室用途：能控制光照和溫度，防止微生物感染，對離體材料進行控制培養(yǎng)要求：應保持干燥和清潔。配置:培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器、搖床等。六、鑒定室用途：對培養(yǎng)材料進行細胞學鑒定和研究。要求：清潔明亮干燥，配置:各種光學儀器七、馴化移植室用途：用于試管小植株的鍛煉和移植。為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件配置: 溫室彌霧裝置蔭棚移植床缽盆塑料布草炭蛭石粗沙等，第一節(jié) 實驗室設置第三章、細胞工程實驗室設置與基

5、本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備實驗室主要儀器設備包括常規(guī)設備、滅菌設備、培養(yǎng)設備等。熟練掌握它們的結(jié)構(gòu)、用途、使用方法及注意事項是順利完成實驗的重要保證。一、常規(guī)設備主要是用于試劑保存與稱量、培養(yǎng)基配制與分裝和水處理等。如天平、冰箱和冰柜 、酸度計 、離心機 、水純化裝置 天平離心機第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備二、滅菌設備（一）高壓蒸汽消毒裝置培養(yǎng)基、蒸餾水、不含糖的緩沖液、培養(yǎng)器皿及其他用具等均需經(jīng)過高壓蒸汽消毒滅菌后方可使用。高壓滅菌器時，一般在121，控溫1540分鐘，既可切斷電源，緩慢降壓至讀數(shù)為0時，方可取出滅菌物。（二）干燥滅菌器 用于各種用具的

6、滅菌。通常采用160180持續(xù)90分鐘來滅菌。 （三）過濾除菌裝置高壓滅菌器濾 器第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備 二氧化碳培養(yǎng)箱養(yǎng)箱養(yǎng)箱倒置顯微鏡三、培養(yǎng)設備（一）培養(yǎng)設備包括培養(yǎng)架培養(yǎng)箱搖床和生物反應器等。（二）倒置顯微鏡多用于隔瓶觀察記錄外植體及懸浮培養(yǎng)物（細胞團原生質(zhì)體等）的生長情況。（三）雙筒實體顯微鏡多用于剝離植物莖尖。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備（四）細胞計數(shù)工具用作培養(yǎng)細胞的計數(shù)和活性的觀察。（五）細胞冷凍保存裝置普通的液氮容器常稱為液氮罐。液氮溫度約為-196，使用時要注意勿使液氮濺到皮膚上，以防凍傷。由于液氮不

7、斷揮發(fā)，應注意觀察存留液氮情況，及時補充液氮，避免揮發(fā)過多而導致細胞受損。（六）其他儀器如磁力攪拌器恒溫水浴箱振蕩器超聲波清洗儀等。冷凍裝置第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備主要金屬器材四、培養(yǎng)容器與用具（一）接種用具用途：主要用于接種外植體解剖動物取材和原代培養(yǎng)中切割組織。消毒方法采用高壓蒸汽消毒或采用70酒精浸泡消毒。 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)培養(yǎng)器皿多孔培養(yǎng)板（二）培養(yǎng)器皿體外培養(yǎng)必須使用大量的各式器皿 第二節(jié) 實驗室主要儀器設備離心管Eppendorf管第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備（三）移液器移液器 1電動移液器

8、：2微量移液器：3多通道可調(diào)式微量移液器 （四）特殊用具第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第二節(jié) 實驗室主要儀器設備五、無菌操作設備超凈（凈化）工作臺是目前已普遍應用的無菌操作裝置。 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 超凈工作臺第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)一、洗滌技術(shù)體外培養(yǎng)細胞使用的器材品種較多，器皿表面常殘留微量有毒物質(zhì)。由于離體細胞對各種毒物都很敏感，除去器皿表面殘留的微量有毒物質(zhì)，改善玻璃表面性質(zhì)，有利于細胞的粘著和生長，所以細胞培養(yǎng)所用器

9、材的清洗消毒處理是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵之一。（一）洗滌劑的配制 常用洗滌劑的配制與適用范圍見書的43頁表3.1 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)(二)洗滌方法A、新購買的玻璃儀器的清洗 表面常附著有游離的堿性物質(zhì)可先用0.5的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在12鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100120烘箱內(nèi)烘干備用。B、使用過的玻璃儀器的清洗 先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（

10、計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)C、 塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，第一次使用塑料器皿時，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH = 1）清洗，接著依次用無離子水、1 mol/L KOH和無離子水清洗，然后用103 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。D、金屬用品洗滌 金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用

11、熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E、除菌過濾器洗滌 用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)二、滅菌技術(shù) （一）滅菌是指殺滅培養(yǎng)物培養(yǎng)基培養(yǎng)用具及培養(yǎng)環(huán)境的雜菌，是防止微生物污染的最重要最基本的環(huán)節(jié)，是細胞工程技術(shù)中必須注意的問題。 （二）、滅菌的方法： 1、 物理方法：干熱、濕熱、過濾（0.25微米）、紫外燈、超聲波等。 2、化學方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)（1）干熱滅菌 適用

12、于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150 、40min或120 、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160 、90120min（2）濕熱滅菌適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121 維持2030min注意點：加足水、排盡氣、氣壓降到0時，才能開蓋（3）過濾滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)（4）射線滅菌 主要是利用紫外燈進行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間20-30min。注意：關(guān)燈

13、后5min后再進入。超凈工作臺關(guān)燈后要打開風機。（5）火焰灼燒滅菌用火焰灼燒達到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。（6）消毒劑適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)注意： （1）實驗器皿、操作表面、皮膚一般用7075%酒精（2）升汞為劇毒藥品，一則使用時注意別濺到皮膚上，二則使用后要進行處理，不能直接導入下水道。 升汞處理方法： 升汞Na2S絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）FeSO4（中和過多的Na2S ） （3）長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的

14、基本操作技術(shù)三、無菌操作技術(shù)1、實驗器具和材料的準備2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺 面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。3、關(guān)紫外燈、打開風機，過5-10min進入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)三、無菌操作技術(shù)4、用7075的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應該用酒精消毒。點燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應在火焰近處并經(jīng)過灼燒進行。金屬器械不能

15、過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。5、取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗34次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進行分離、切割或其他處理。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)三、無菌操作技術(shù)6、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。7、用酒精擦洗工作臺和手。進行下一輪操作。注意事項（1）進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸

16、，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)三、無菌操作技術(shù)注意事項（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。（5）吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录毎徊嫖廴?。?）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。（7）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應將吸管丟掉。第三章、細胞工

17、程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)四、外植體的選擇與處理技術(shù) 用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源： 一是生長在自然環(huán)境下的植物； 二是在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物； 三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物。 （一）、外植體的選擇 （二）、外植體的處理 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)四、外植體的選擇與處理技術(shù) （一）、外植體的選擇 1、選擇優(yōu)良的基因型 試驗首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應選擇當?shù)卦耘啻_認的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠。花卉、觀賞植物的快繁，也應選擇有

18、價值的植物。 2、取材 從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強，試驗容易成功。 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)四、外植體的選擇與處理技術(shù) （一）外植體的選擇 3、外植體大小選擇 因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。（以后具體講） 4、選擇外植體的時期 外植體的生長動態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長的最適宜時期取材培養(yǎng)。會得到較好的結(jié)果。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第三節(jié) 細胞工程的基本操作技術(shù)（二）、外植體的處理 1、取材母株的

19、預處理 人工管理，促進母株生長旺盛、代謝活躍，從其上取材培養(yǎng)，容易成功。 2、外植體休眠的處理 有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時間有所不同。 3、 組織內(nèi)生菌的 處理 （1）加入抗生素，注意抗生素的用量，高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡 （2）取生長期旺盛的生長點部位作為起始培養(yǎng)的外植體。 （3）取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的 莖尖不停的轉(zhuǎn)接。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇一、培養(yǎng)基的成分及其作用（一）無機營養(yǎng)物質(zhì) 大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, S。 微量元素有Fe、Cu

20、、Zn、B、 Mo、Mn、Co，Cl（二）有機化合物 維生素類物質(zhì) 氨基酸類物質(zhì) 糖類物質(zhì) 一些其它的有機添加物 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（二）.有機化合物 1、維生素類物質(zhì) 維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。 硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素 鹽酸吡哆醇（VB6）促進根的生長 煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進胚的發(fā)育 有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（二）有機化合

21、物2、AA類物質(zhì)絕大多數(shù)AA適量時對培養(yǎng)效果都有正象效應。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖類糖在培養(yǎng)基的作用： 1）為細胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 2）為細胞的呼吸代謝提供底物和能量 3）維持滲透壓蔗糖是廣泛應用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（二）有機化合物4、其它有機物質(zhì)1）肌醇（環(huán)己六醇） 肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，參與細胞膜的組成。利于胚和芽的形成2）天然有機物 一些天然的有機物如椰乳、番茄提取物、

22、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進作用。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機物，而植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。 無機元素和有機營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導細胞分裂、脫分化和再分化。1、生長素類：2、細胞分裂素3、赤霉素（GA3）4、脫落酸（ABA）（第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)1、生長素類：1）吲哚類：IAA（

23、吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 2）萘酸類： NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強的生長素。 生長素的生理作用1）促進細胞生長和細胞分裂2）誘導受傷組織表面細胞恢復分裂能力3）形成愈傷組織，促進生根4）與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)2、細胞分裂素 是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（ 6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6芐基氨基嘌呤

24、。 功能：1）促進細胞的分裂和分化2）誘導芽的分化3）促進側(cè)芽的萌發(fā)和生長4）抑制衰老第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 3、赤霉素（GA3）生理作用：1）誘導莖的細胞伸長，對矮生型植物恢復成高生型特別有效，對根無效2）對形成層的細胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。3）破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。4）對生長素和細胞分裂素的活性有增效作用注：不耐熱，應采用過濾滅菌加入第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 4、

25、脫落酸（ABA）生理作用：1）、抑制蛋白質(zhì)的合成2）、抵消和抑制生長素、細胞分裂素、GA的作用3）、誘導休眠、促進衰老和脫落第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（四）固化劑和懸浮劑1、固化劑 瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)） 瓊脂的用量一般在4-10g/L，所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。2、懸浮劑Ficoll（聚蔗糖）第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇（一）培養(yǎng)基的種類 根據(jù)無機鹽的濃度，培養(yǎng)基分為：

26、 高無機鹽含量培養(yǎng)基、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基 、中等無機 鹽含量培養(yǎng)基、低無機鹽含量培養(yǎng)基 根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為: 初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。 根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為 誘導培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。 根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為 基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇（二）培養(yǎng)基的篩選1.無機營養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用B5培養(yǎng)基。2植物生長調(diào)節(jié)劑：必須進行篩選試驗?？傮w原則-當誘導愈傷組織形成時，細胞分裂素

27、和生長素相對平衡；誘導芽分化時，細胞分裂素水平應高于生長素，誘導根則要低。3有機成分要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復雜有機成分，而進行細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇三、培養(yǎng)基的配制方法（一）貯備液（母液）的配制包括：大量元素母液微量元素母液鐵鹽母液有機母液激素母液配制等（詳見植物細胞工程實訓部分）第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇（二）培養(yǎng)基的配制步驟1、計量 根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量 ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）1000ml

28、/母液濃度（mg/L）。2、移液 取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。注意 （1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。（2）量取母液時，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。3、稱取瓊脂蔗糖備用第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇4、融化 用搪瓷量杯量取600700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。 5、混合將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸

29、餾水定容到1000ml，來回混合幾次。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇6、調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.47.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達到要求為止(在調(diào)制時要比目標pH值偏高0.20.5個單位，因為培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會下降0.20.5個單位左右)。第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第四節(jié) 培養(yǎng)基的成分、配制與選擇7、分裝 溶化的培養(yǎng)基應該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的

30、1/51/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝2030瓶。8、包扎 用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號。9、培養(yǎng)基的滅菌第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)培養(yǎng)條件的選擇十分關(guān)鍵。培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學環(huán)境條件都回影響組織一.光照的影響主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光周期等方面： 光周期：黑暗與光照交替的時間；光量：光照強度；光質(zhì)：光的波長離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 愈傷組織誘導階段，一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，多數(shù)植物適合

31、全暗或周期性光照， 器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。第五節(jié) 培養(yǎng)條件的選擇第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第五節(jié) 培養(yǎng)條件的選擇二.溫度的影響 培養(yǎng)都是在2327之間進行，一般采用252。 喜溫性植物：茄科、禾本科、蘭科等。培養(yǎng)溫度一般控制在26-28 冷涼性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培養(yǎng)溫度控制在18-22 或25 第三章、細胞工程實驗室設置與基本技術(shù)第五節(jié) 培養(yǎng)條件的選擇三.濕度的影響 組織培養(yǎng)中濕度的影響有兩個方面： 一是培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。 一是環(huán)境的濕度條件。環(huán)境的相對濕度一般要求7080%。常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法