制備型高效液相色譜

1、 制備型高效液相色譜1 在生物制藥中的應(yīng)用基因工程藥物:白細(xì)胞介素、胰島素。天然產(chǎn)物: 蛋白質(zhì),多肽,多糖。2 第一節(jié) 高效液相色譜法簡(jiǎn)介液相色譜的發(fā)展史 1903年，色譜法問(wèn)世俄國(guó)植物學(xué)家茨維特 1903年3月21日，大會(huì)報(bào)告 “一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用” 1906年在德國(guó)植物學(xué)雜志發(fā)表文章，首次命名上述分離后色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法 1931年，庫(kù)恩（Kuhn）分離胡蘿卜素，1938年，Kuhn和Lederer從維生素B中分離出B6，獲得了1938年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1941年，馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出液液分配色譜法，1952年度的諾貝爾獎(jiǎng)。60年代末

2、，70年代初，高效液相色譜儀的成功研制3 1.2 基本儀器裝置輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)4 5 2.1 高效液相色譜儀組成1 輸液系統(tǒng) (1) 高壓輸液泵作用：將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。高壓輸液泵在線脫氣裝置6 (1) 高壓輸液泵7 (2)在線脫氣裝置作用：脫去流動(dòng)相中的溶解氣體。流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣 裝置再輸送到色譜柱。在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。Pressure Dampers O2, N2, CO28 （3）梯度洗脫裝置Isocratic el

3、ution恒定組成的單一溶劑體系Gradient elution以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分High-Pressure Mixing9 2 進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥10 3 色譜柱Normal column 5-m、4.6- mNarrow bore column 1-3 mMicro column 1 m 色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。 11 色譜柱填料spherical and irregular silica particles Macroporous spherical si

4、lica particle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979 基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù)m數(shù)十m，球形。 硅膠或有機(jī)高分子聚合物12 Pellicular particlePorous particle30-50m1-2m3-10m13 色譜柱填料功能層：物理吸附或化學(xué)鍵合14 三、高效液相色譜法的特點(diǎn)采用高效色譜柱、高壓輸液設(shè)備和高靈敏度檢測(cè)器, 從而實(shí)現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定量準(zhǔn)確。和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏度高、分辨率高、自動(dòng)化程度高 等。15 四、制備型高效液相色譜與分析型高效液相色譜法的區(qū)別 流速不同檢測(cè)池不同上樣量不同色譜柱

5、不同16 五、色譜的基本理論及有關(guān)參數(shù) 兩大理論：塔板理論(the plate model):闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成；相似于精餾過(guò)程，色譜分離也是一個(gè)分配平衡過(guò)程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2速率理論:研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響。 H= A+Cu17 有關(guān)參數(shù)分離度：在色譜過(guò)程中表示兩組分相互分離的程度,一般情況下,分離度大于1.5時(shí)稱分離完全. 只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。 在色譜分析中要求： 兩組分的保留值差別要足夠大。 兩色譜峰要足夠窄。 待測(cè)組分的分離度要足夠

6、大，分離過(guò)程要盡可能短.18 容量因子：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與流動(dòng)相中總摩爾數(shù)之比。選擇因子：兩組分容量因子的比值容量因子、選擇因子、理論塔板數(shù)對(duì)分離度的影響19 六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)Capacity:純化過(guò)程中，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量?？梢允求w積也可以是質(zhì)量。Speed:在除去蛋白酶的過(guò)程中此項(xiàng)非常關(guān)鍵。Recovery:產(chǎn)品貴重時(shí)此項(xiàng)很重要。流動(dòng)相的條件、環(huán)境會(huì)影響它。減少步鄹和保持一種對(duì)生物樣品合適的環(huán)境條件。Resolution:在純化的最后階段，此項(xiàng)很關(guān)鍵，尤其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時(shí)。20 七、分離機(jī)理和色譜類型 分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時(shí)的分離依據(jù)：疏水性分子大小等電點(diǎn)結(jié)

7、構(gòu)特異性21 色譜介質(zhì)按分離機(jī)理分為正相色譜反相色譜：常加入TFA離子交換色譜：陰離子交換色譜（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺鹽）陽(yáng)離子交換色譜（CM羧甲基S磺酸基）凝膠過(guò)濾色譜疏水色譜：苯基，辛基等。金屬螯合色譜：鎳、銅等親合色譜 22 第二節(jié) 分離方案的設(shè)計(jì)What is the intended use of the product?What kind of starting material is available and how should it be handled?What are the purity issues in relation to the source mat

8、erial and intended use of the final product?What has to be removed?What must be removed completely?What will be the final scale of puridication?What are the economical constraints and what resources and equipment are available?23 一、分離方法之間的組合 四步純化法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrate and stabili

9、ze)Intermediate purification:(Remove bulk impurities)Polishing:(Achieve final high level purity)24 色譜之間的組合方案AC、GF、IEX、HIC25 二、分離條件的優(yōu)化 合適的溶劑強(qiáng)度:容量因子k 足夠的柱效N: 良好的分離選擇性:26 當(dāng)柱過(guò)載時(shí)：1 N和k都隨樣品負(fù)荷的增加而迅速地減小2 流速對(duì)于塔板數(shù)N的影響大大地降低 3 通過(guò)增加柱長(zhǎng)來(lái)有效地提高柱效，不宜通過(guò)降低柱壓（或流速）來(lái)達(dá)此目的 27 28 29 制備分離的兩種途徑： 第一種，基本上同于分析型，進(jìn)樣量不過(guò)載，利用大內(nèi)徑的柱，通過(guò)調(diào)

10、整分離方程中的有關(guān)參數(shù)來(lái)達(dá)到分離的最佳化。在該法中往往利用小顆粒的填料（約10m）來(lái)制取少量?jī)r(jià)值高而難分離的物質(zhì)。 第二種，使用大粒度填料（50m）的大內(nèi)徑柱，在過(guò)載情況下制備相對(duì)大量的純物質(zhì)。當(dāng)值相當(dāng)大時(shí)（例如1.2），提高洗脫液的流速并不至于嚴(yán)重降低分離度，從而大大縮短分離時(shí)間。 30 三、制備型高效液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法待分離成分呈單一主峰不易分開(kāi)的兩組分目的組分含量少31 待分離成分呈單一主峰32 不易分開(kāi)的兩組分33 目的組分含量少34 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)條件的選擇 色譜柱的選擇與填裝柱填料流動(dòng)相選擇檢測(cè)器的選擇儀器設(shè)備35 一、柱的選擇和裝填 柱：不銹鋼柱： 200kg ，生物適應(yīng)性

11、差玻璃柱：1015kg聚合物柱： 裝填：當(dāng)粒度小于20m，用較大的勻漿罐濕法填裝。粒度大于30m時(shí)；利用輕敲柱外壁的干填法36 二、柱填料 硅膠：葡聚糖和瓊脂糖：高分子聚合物：37 顆粒大小38 在很小的分離制備中，要求較高的N值，宜用小粒度的填裝柱。當(dāng)很大時(shí)，用大顆粒填裝柱，對(duì)過(guò)載進(jìn)樣是有好處。 39 三、洗脫劑 可利用相同填料的分析柱，選擇最適合于分離目的和要求的流動(dòng)相的組成（如溶劑的配比，離子強(qiáng)度，pH等），將其直接或略加修改后用于制備分離 一般不采用梯度洗脫 選擇合適的溶劑溶解樣品采用色譜純的試劑40 四、儀器設(shè)備對(duì)泵的精密度和準(zhǔn)確度要求不高（ 0.01100mL/min ）對(duì)檢測(cè)器的

12、高靈敏要求不高流路系統(tǒng)盡可能用惰性聚合材料 柱外效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果影響較小 41 第四節(jié) 操作變量的確定 一、樣品的進(jìn)樣量宜注射低濃度大體積的樣品，不宜注射高濃度小體積的樣品。樣品進(jìn)樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相和固定相的類型、樣品的溶解性以及分離目的有關(guān)。42 柱內(nèi)徑，mm困難的分離（1.2），mg容易的分離（1.2），mg20.2252581050100500251005001000500043 二、制備產(chǎn)率 產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。不過(guò)載的柱子，k值較小時(shí)，產(chǎn)率較高。用全孔填料時(shí)產(chǎn)率高于用薄殼型的。對(duì)于值小的分離，宜利用小粒度（510m）填料的柱子；在較大時(shí)，使用較大顆粒、大內(nèi)徑的柱，將獲

13、得較高的產(chǎn)率，且價(jià)格便宜。柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。 產(chǎn)率隨柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的流速的增加而增加。 44 三、回收率計(jì)算和純度鑒定除去組分中的溶劑：熱的氮?dú)饬鞔担婵招D(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。純度：HPLC，TCL?；厥章剩褐亓浚钚?。45 蛇毒中溶栓組分的分離46 47 制備型高效液相色譜的應(yīng)用肽的分離蛋白質(zhì)的分離多糖的分離核酸的分離48 肽的分離： 常用方法為反相色譜和離子交換色譜 肽的保留時(shí)間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預(yù)測(cè)。 反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對(duì)反相色譜。 肽的檢測(cè)：UV200230nm，熒光檢測(cè)。49 蛋白質(zhì)的分離1填料：孔徑3005002流動(dòng)相（1）pH 低pH使

14、蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，極性降低，與反相鍵合相的作用強(qiáng)。對(duì)大多蛋白質(zhì)而言，使用pH2.53.5的流動(dòng)相可以得到最好的分離。50 （2）離子強(qiáng)度和離子對(duì)試劑 增加離子強(qiáng)度增加了蛋白質(zhì)與鍵合相的疏水作用，較高的離子強(qiáng)度（0.2）可使蛋白質(zhì)有較好的分辨率和回收率。 緩沖液中的鹽還能通過(guò)形成離子對(duì)改變蛋白質(zhì)分子表面極性。反離子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），復(fù)合離子對(duì)保留時(shí)間增長(zhǎng)。如果反離子是親水的（如磷酸根、甲酸根），則復(fù)合離子對(duì)保留時(shí)間減少。 51 （3）有機(jī)溶劑 有機(jī)溶劑的選擇是改變蛋白質(zhì)保留性的重要手段之一。較常用的有乙腈和丙醇。使用復(fù)合溶劑（如異丙醇-乙醇、乙腈-異丙醇等）可降低有機(jī)溶劑總濃度并改善分辨率及回收率。 52 （4）表面活性劑 兩性離子表面活性劑可以減少高分子量、疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)的拖尾，使分離得以改善。（5）溫度 為了防止蛋白質(zhì)的不可逆變性和失活，分離一般在室溫或低溫下進(jìn)行。 53 三、多糖的分離 分離：高效體積排阻色譜 檢測(cè)：常用示差折射儀