槐耳水提物通過誘導細胞凋亡抑制乳腺癌細胞增殖(共16頁)

1、槐耳水提物通過誘導細胞凋亡(dio wn)抑制乳腺癌細胞增殖Ning Zhang1、Xiaoli Kong1、Shi Yan2、Cunzhong Yuan2和Qifeng Yang1,31山東大學醫(yī)學院齊魯醫(yī)院乳腺(rxin)外科，2山東大學(shn dn d xu)醫(yī)學院齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，（收稿日期：2010年3月14日，修訂日期：2010年6月30日，接受日期：2010年7月9日；在線文稿接受日期：2010年7月16日）近年來，生長在中國槐樹干上的槐栓菌（槐耳）在中國常被用于癌癥輔助治療；然而人們對槐耳的抗癌作用機制仍知之甚少。本研究旨在研究槐耳對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的

2、抑制作用，并探究其可能的抗癌作用機制。我們分別采用MTT、侵襲性測定以及細胞移行和體外劃痕試驗測定細胞活力和移動能力。通過流式細胞儀對細胞周期分布以及PI-膜聯(lián)蛋白-V染色和羅丹明123測定結(jié)果進行分析，采用蛋白印記試驗測試細胞凋亡通路。我們發(fā)現(xiàn)槐耳提取物能時間和劑量依賴性地強烈抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞活力；但是，MDA-MB-231細胞對處理更為敏感。此外，細胞侵襲和移行能力也因加入槐耳提取物而受到抑制。我們還注意到，槐耳能有選擇地在MCF-7細胞中誘導G0/G1周期阻滯和p53積聚及活化。令人鼓舞的是，PI-膜聯(lián)蛋白-V染色測定和蛋白印記分析證實了半胱天冬酶3完成的細胞凋亡

3、。羅丹明123測定中，線粒體膜電位降低、BCL2下調(diào)以及BCL2相關(guān)X蛋白（BAX）上調(diào)，都說明槐耳通過線粒體通路誘導凋亡?；倍T導凋亡期間的半胱天冬酶活化通過泛Caspase抑制劑Z-VAD-fmk得到確認。與預期一致的是，抑制劑使兩種細胞系中的槐耳誘導凋亡均下降。根據(jù)我們的研究發(fā)現(xiàn)，槐耳能誘導ER陽性和ER陰性乳腺癌細胞系中的細胞凋亡，是一種有效的乳腺癌治療輔助藥劑。(CancerSci2010)預計世界上每年有100多萬女性被診斷患有乳腺癌，并且每年約有41萬人死亡(1)。乳腺癌已經(jīng)成為東南亞國家女性中僅次于胃癌的癌癥死亡主要原因(2)。在中國某些地區(qū)，乳腺癌發(fā)生率每年上升5%，高于全球

4、平均上升率(3)。在美國，與其它癌癥相比，乳腺癌預后較好，500多萬存活者占了所有癌癥生存者的近23%。盡管一期和二期局部病變的5年存活率估計分別達到98%和94%(4)，但晚期乳腺癌的治療方式仍十分有限(5)。對于乳腺癌治療，常規(guī)治療方式很多，包括手術(shù)、放療、化療、激素治療以及其它輔助療法(6)。然而，這些療法不能完全防止癌癥復發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此癌癥患者極需新的藥物和療法。在輔助療法中，傳統(tǒng)中藥（TCM）因其在殺滅癌細胞方面的奇特作用（低強度、更自然）而被越來越廣泛地應用(7)。在亞洲，中醫(yī)有三千年歷史。幾年前的一項回顧性分析證實，62%的可進行商業(yè)應用或后期開發(fā)的抗感染和抗癌藥物都是源自自然的

5、藥物(8)。中藥含有多種復雜化合物，例如生物堿、類固醇和蛋白聚糖(9,10)，在安全劑量下可產(chǎn)生獨特的抗癌作用。槐耳是中國的一種藥用真菌，中藥名稱槐栓菌入藥歷史約有1600年(11)；但直到近幾十年，槐耳用于輔助療法的抗腫瘤性能才被發(fā)現(xiàn)和利用。真菌用熱水浸提兩次，并采用Sevag法清除游離蛋白和氨基酸。透析72小時后，在透析液中添加四倍量的乙醇以使有效成分沉淀。HPLC和SDS分析證明，槐耳提取物的有效成分是蛋白聚糖，其中包含41.53%的多糖、12.93%氨基酸和8.72%的水(12,13)（表S1）。另外，針對蛋白聚糖對S180鼠肉瘤細胞、H22肝癌細胞、Lewis肺癌以及MCF-7乳腺癌

6、細胞的抑制作用的研究證實，蛋白多糖是槐耳提取物中的主要有效成分。盡管蛋白聚糖在所有單獨的成分中最有效，其有效性仍低于槐耳提取物(12,13)。因而有理由推斷，槐耳提取物的活性可能來源于其協(xié)同或加性效應?；倍崛∥锏目鼓[瘤作用呈現(xiàn)多種生物活性，例如細胞凋亡、抗血管再生、抗血管形成、耐藥性逆轉(zhuǎn)、抗轉(zhuǎn)移以及免疫系統(tǒng)激活。盡管最近實驗數(shù)據(jù)揭示了細胞凋亡作用，但其潛在機制仍未得到詳細研究。另外，除細胞凋亡外，可能還存在其它抗腫瘤作用。本實驗中，我們對槐耳在乳腺癌細胞中的抗腫瘤機制進行了研究。材料和方法材料達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）購自Gibco-BRL (Rockville, IN，美國)。

7、胎牛血清（FBS）由天津市灝洋生物制品科技有限責任公司提供。抗-Bcl-2 (1:250), BCL2相關(guān)X蛋白 (BAX) (1:500)和p53 (1:1000)抗體購自Dako Corp. (Carpinteria, CA，美國)；磷酸化p53 (1:1000)和半胱天冬酶購自Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)?？剐∈驣gG辣根過氧化物酶 (HRP)抗體(1:3000)由北京中山金橋提供。蛋白印記檢測用HRP介質(zhì)由天根生化科技（北京）有限公司提供。其它所有化學品均源自Merck (Darmstadt, Germany)和Sigma-A

8、ldrich (St Louis, MO，美國)。3通信聯(lián)系人。E-mail: qifengy槐耳水提物的制備(zhbi)槐耳膏劑由蓋天力藥業(yè)有限公司（中國江蘇）贈送(zn sn)。將2克膏劑溶于20毫升完全培養(yǎng)基中并進行滅菌，用0.22 m濾膜過濾后得到100毫克/毫升(ho shn)儲備液，于-20長期(chngq)儲存(14,15)。細胞培養(yǎng)將源自American Type Culture Collection (ATCC)的兩種乳腺癌細胞系（MCF- 7細胞和MDA-MB-231細胞）以及NIH3T3成纖維細胞置于DMEM培養(yǎng)基中進行常規(guī)培養(yǎng)（5%二氧化碳，37），添加10% FBS、

9、100 UmL青霉素和100 lg mL鏈霉素。細胞活力測定通過3-(4, 5-甲基噻唑-2-yl)-2, 5-二苯基溴化四唑(MTT)分析測定細胞活力。于5%二氧化碳和37條件下，將MCF-7（3103細胞 孔）和MDA-MB-231（1.5103細胞孔）細胞放進96孔培養(yǎng)板中的DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、100 g mL青霉素和100 UmL鏈霉素）中培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后，用含不同濃度槐耳的DMEM培養(yǎng)基替代DMEM培養(yǎng)基，并單獨培養(yǎng)24、48或72小時。隨后，在各孔中加入20 L的MTT（PBS中5 mgmL），并于37下再將細胞培養(yǎng)4小時。然后小心吸取上清液，并在各個孔中添加100

10、L的二甲亞砜（DMSO）。將培養(yǎng)板搖動10分鐘，并通過酶標儀 (Bio-Rad, Hercules, CA，美國)于570 nm下讀取吸光度值.(16)。使用完全DMEM培養(yǎng)基稀釋槐耳提取物，最終濃度為0、2、4、8和16 mgmL?；倍鷮毎螒B(tài)的影響使用濃度為4mg/ml的槐耳水提液對MCF-7和MDAMA-231細胞進行24和48小時培養(yǎng)。在奧林巴斯光學顯微鏡下觀察經(jīng)處理及陰性對照細胞的形態(tài)24和48小時，并且使用奧利巴斯（日本東京）數(shù)碼相機拍攝顯微照片。侵襲測定使用Transwell系統(tǒng)（24孔，聚碳酸酯膜孔徑8 lm；Corning Costar, Lowell, MA，美國），進行

11、體外侵襲測定，以確定槐耳引起的MDA-MB-231細胞侵襲能力的變化。于37無血清培養(yǎng)基中，細胞饑餓處理12小時。于37下，使用40 L基質(zhì)膠 (1.5 mg mL; BD Biosciences, San Jose, CA，美國)對聚碳酸酯膜進行2小時涂層，以形成再生基膜。向transwell下室中添加500微升NIH3T3成纖維細胞條件培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平衡混合物，并向上室添加1105MDAMB-231細胞。對照組細胞懸浮于100 uL 0.1% BSA的無血清培養(yǎng)基中，而在試驗組中，培養(yǎng)基中還含有4 mg mL槐耳。經(jīng)過18小時培養(yǎng)后，用棉簽擦除基膜上表面以清除附著的細胞。然后將上室放

12、進一個新的培養(yǎng)板中，使粘附在下表面的細胞在95%乙醇中保持10分鐘。Cell viability (of control) 細胞活力（對照組）Huaier extract (mg/mL conc.)槐耳提取物（ml/mL濃度）圖1 槐耳提取物抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞的活力。通過MTT分析法測定槐耳對細胞活力的影響。(a) MCF-7和(b) MDA-MB-231細胞用槐耳處理24、48和72小時?；倍崛∥飼r間和劑量依賴性地顯著抑制兩種細胞系的細胞活力。所進行的實驗重復三次，數(shù)據(jù)分別以平均值 標準差表示。(a) 0小時24小時48小時(b) 0小時24小時48小時圖2 槐耳提取

13、物使MCF-7和MDA-MB-231細胞發(fā)生(fshng)形態(tài)變化。添加槐耳（4 mg mL）前、后的(a) MCF-7和(b) MDA-MB-231細胞(xbo)的相差圖像于0、24和48小時時拍攝。最后，用吉姆薩染液對細胞(xbo)染色。采用奧林巴斯光學顯微鏡得出6個代表性區(qū)中侵襲和粘附于下表面的細胞計數(shù)(j sh)(1719)。移行(y xn)測定移行測定方法與上述侵襲測定基本相同，所不同的是移行測定不用基質(zhì)膠對基膜進行涂層。向上室添加MDA-MB-231 (1105細胞孔)和MCF-7 (1105細胞孔)細胞，對照組加入培養(yǎng)基，試驗組的處理與侵襲測定相同。于37培養(yǎng)5小時后，以和侵襲研

14、究相同的方式進行細胞染色和計數(shù)(17)。體外劃痕試驗為評估槐耳水提物對細胞運動能力的影響，對MCF-7和MDA-MB-231細胞進行了劃痕試驗。用0.1%和胰蛋白酶和0.1% EDTA完成消化后，分別以4105和2105的密度在24孔培養(yǎng)板中對MCF-7和MDA-MB-231細胞進行接種。標記靠近“劃痕”的參考點，確保得到同一位置的圖像，并將參考點置于37的培養(yǎng)板中。細胞在完全培養(yǎng)基中生長2天以便產(chǎn)生一個融合單層，并用p20微量移液“槍頭”末端劃痕，從而產(chǎn)生一條直線形無細胞的“劃痕”。用PBS沖洗各培養(yǎng)孔兩次，以清除碎片和使劃痕邊緣平滑，然后代之以無血清槐耳水提物 (4 mg mL)。然后，對

15、于第一張圖像，用相差顯微鏡拍攝匹配參考點“劃痕”中細胞的移行情況，隨后圖像間隔12小時拍攝(20,21)。通過ImageJ對圖像進行定量分析；在參考點測量劃痕兩邊緣之間的距離并進行統(tǒng)計學分析。細胞周期分析采用經(jīng)過修改的標準方法(22)進行細胞周期分析。簡言之，在6孔培養(yǎng)板中對5105細胞/孔進行接種，并在37無血清培養(yǎng)基中進行饑餓處理。饑餓12小時后，用槐耳溶液和完全培養(yǎng)基對細胞進行24或48小時處理。然后對細胞進行消化，用冷PBS沖洗，并使用含3% FBS的70%乙醇于-20過夜固定。第二天對固定細胞進行1分鐘的1200g離心，并用PBS沖洗兩次。然后使用200 L RNase A (1 m

16、g mL)將細胞重懸，于37孵育10分鐘，接著添加300 L碘化丙啶 (PI, 100 lL mL)，于暗處對細胞進行DNA染色。室溫下孵育20分鐘后，用FACScan流式細胞儀 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ，美國)分析細胞的DNA含量，并使用ModFitLT V2.0 軟件 (Becton Dickinson)進行數(shù)據(jù)分析。 control對照物 Huaier槐耳（4 mg/mL）Cell number細胞數(shù)量control對照物 Huaier槐耳圖3 在侵襲和移行試驗中，槐耳提取物 (4 mg mL)對細胞運動能力產(chǎn)生強烈抑制。(a) 使用Tr

17、answell系統(tǒng)對MDA-MB-231進行的侵襲試驗表明，用槐耳進行18小時處理后產(chǎn)生侵襲抑制作用。(b) 有或無槐耳處理情況下的成功侵襲MDA-MB-231細胞數(shù)量。(c) 經(jīng)5小時槐耳處理后的MDA-MB-231細胞移行試驗。(d) 使用(shyng)基質(zhì)膠對基膜進行涂層后，在對照組和槐耳處理組之間進行MDA-MB-231細胞數(shù)量(shling)對比。(e) 5小時(xiosh)槐耳處理后的MCF-7細胞移行試驗。(f) MCF-7細胞數(shù)量減少表明槐耳的抑制作用顯著。使用Giemsa染液，并完成6個代表性區(qū)段的細胞計數(shù)。數(shù)據(jù)以平均值 標準差表示。通過PI-膜聯(lián)蛋白-V染色進行(jnxng

18、)細胞凋亡識別本試驗旨在進行細胞凋亡(dio wn)檢測，試驗使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（晶美生物工程(shn w n chn)有限公司，中國北京），參照生產(chǎn)商說明進行。簡言之，將得到的細胞置入100 L結(jié)合緩沖液中進行重懸，使之達到1106/mL的濃度。接著添加5 L膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 L碘化丙啶 (PI, 20 g mL)，并于暗處孵育15分鐘。最后，在使用FACScan流式細胞儀進行細胞分析之前，向各反應試管添加400 L結(jié)合緩沖液。使用WinMDI V2.9軟件（The Scripps Research Institute, San Diego, CA，美國)進

19、行數(shù)據(jù)分析(22)。線粒體膜電位（MMP）測定通過不同濃度的槐耳進行處理后，將獲得的MDA-MB-231和MCF-7細胞懸置于PBS中。添加1L羅丹明123 (5 lg mL)，并于暗處37孵育1小時。然后用PBS沖洗細胞兩次并重懸。使用FACScan流式細胞儀測定了10000個細胞的線粒體膜電位，結(jié)果以平均熒光強度（MFI）表示。蛋白印記分析以梯度時間（24和48小時）和濃度（4和8mg/mL），使用槐耳提取物對MDA-MB-231和MCF-7進行處理。收集經(jīng)特別處理細胞的蛋白，并在含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中溶解(23)。通過12% SDS分離80g蛋白，并使用半干式印記儀器 (Bio-R

20、ad, Hercules, CA，美國)轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂乳進行封閉后，以一抗于4對基膜進行過夜孵育，隨后使用二抗進行標記。使用Pro-lighting HRP試劑顯現(xiàn)蛋白帶。使用-肌動蛋白作為內(nèi)參，對照組細胞在不含槐耳的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。統(tǒng)計評估使用軟件SAS V9.1 (SAS InstituteInc., Cary, NC，美國)進行統(tǒng)計分析，采用Studentt檢驗分析統(tǒng)計差異。P 0.05被視為差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值 標準差表示，實驗重復三次。結(jié)果在MCF-7和MDA-MB-231中，槐耳抑制細胞活力并引起細胞形態(tài)變化。為評估槐耳提取物對MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞

21、的影響，在使用槐耳對細胞進行24、48和72小時劑量依賴性地處理后，我們通過MTT試驗測定了細胞活力。如圖1所示，槐耳時間和劑量依賴性地對MCF-7 (圖1a) 和MDA-MB-231 (圖1b)細胞的活力產(chǎn)生顯著抑制。不論對于MCF-7還是MDA-MB-231細胞，細胞活力均在達到8 mg mL時急劇下降，并與處理時間無關(guān)。然而，MDA-MB-231顯示48和72小時時的細胞毒性更為明顯。經(jīng)過72小時4mg/mL濃度暴露后，MDA-MB-231細胞的活力幾乎下降80%，但MCF-7細胞活力僅降低42%。以4 mg mL濃度槐耳進行24和48小時處理后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的形

22、態(tài)變化如圖2所示。與未經(jīng)處理細胞相比，絕大多數(shù)經(jīng)過槐耳處理的MCF-7細胞變大、形狀異常、呈刺狀以及產(chǎn)生細胞質(zhì)空泡變化（圖2a），而許多MDA-MBM-231細胞變得極長，并呈現(xiàn)特殊的“拉絲”形態(tài)（圖2b）。這些形態(tài)變化表明，槐耳處理后發(fā)生了細胞損傷。細胞因暴露于槐耳提取物而運動能力下降為探究槐耳提取物是否影響細胞活力，進行了體外侵襲、移行和劃痕試驗。（圖中內(nèi)容）Control對照物 Huaier (4mg/mL) 槐耳（4mg/mL）Wound distance (of control distance) 損傷距離（對照距離）Control 對照物 Huaier 槐耳Time (h) 時間（

23、小時）圖4 劃痕試驗(shyn)顯示損傷愈合過程延遲。 (a) 未經(jīng)處理(chl)及經(jīng)過4 mg mL濃度(nngd)槐耳處理的MCF-7細胞的圖像于0、12和24小時時拍攝。 (b) “損傷愈合”定義為各損傷處兩邊緣之間的起始距離百分率。經(jīng)過槐耳處理的MCF-7細胞顯示，其損傷愈合速度比對照細胞慢。 (c) 經(jīng)過和未經(jīng)過槐耳處理(4 mg mL)的MDA-MB-231細胞的圖像于0、12和24小時時拍攝。 (d) 槐耳處理孔中劃痕兩邊緣之間的距離大于對照距離。與MDA-MB-231細胞(xbo)相比，MCF-7細胞被認為(rnwi)是一種(y zhn)非侵襲性細胞系(24)，所以上述侵襲試驗

24、未涉及MCF-7細胞。體外侵襲試驗旨在對比經(jīng)過和未經(jīng)過槐耳處理的MDA-MB-231細胞的侵襲潛力。從圖3a、b中可以看出，穿過基質(zhì)膠涂層膜的侵襲細胞的數(shù)量明顯多于對照組。體外移行和劃痕試驗旨在從不同方面確定細胞的移行能力，兩種試驗的結(jié)果一致。如圖3c、d所示，與未經(jīng)處理細胞 (93.67 6.66; P = 0.0006)相比，經(jīng)過4mg/mL濃度槐耳處理的MDA-MB-231細胞的移行運動受到顯著抑制 (39.67 7.02)。與其相似，與對照細胞 (19.67 4.73; P = 0.0188)相比，MCF-7細胞移行也受到相同濃度槐耳提取物的明顯抑制 (0.67 0.58)（圖3e、f

25、）。劃痕試驗如圖4所示，各培養(yǎng)孔在開始時產(chǎn)生一個劃痕區(qū)域，而與之相比，槐耳處理（4mg/ml/）會延遲劃痕區(qū)域的閉合?；倍幚碚T導MCF-7細胞中的細胞周期捕獲，但在MDA-MB-231細胞中不存在經(jīng)過槐耳處理的MCF-7和MDA-MB-231細胞的周期分布通過流式細胞儀進行分析，旨在確定抑制作用是否因細胞周期阻滯而產(chǎn)生。進行處理和分析之前，兩種細胞均處于一系列不用槐耳濃度的培養(yǎng)基中，總處理時間為24或48小時。如圖5所示，與未經(jīng)處理細胞相比，處理組的MCF-7細胞出現(xiàn)G0/G1期比例增加，從而說明了G0/G1期阻滯。通過槐耳的處理還隨之降低了S相比例。這些結(jié)果表明，槐耳能通過G0/G1期的細

26、胞周期阻滯抑制MCF-7細胞增殖。然而，通過流式細胞儀測得的槐耳處理過的MDA-MB-231細胞的細胞周期分布類似于未經(jīng)處理對照細胞（數(shù)據(jù)未顯示）。通過PI-膜聯(lián)蛋白-V染色和MMP測定進行細胞凋亡分析可通過PI-膜聯(lián)蛋白-V雙重染色，可以區(qū)分完整細胞、早期凋亡細胞或死亡細胞 (25)，因此為進一步探究細胞凋亡問題，我們進行了此項測定。圖6和表1顯示，槐耳處理后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的晚期凋亡或細胞死亡率以及早期凋亡率呈現(xiàn)時間和劑量依賴性地升高趨勢。為探知槐耳誘導凋亡期間的半胱天冬酶活化情況，我們還研究了泛Caspse抑制劑Z-VADfmk對凋亡誘導的影響。和預期一致，泛抑制劑

27、使MCF-7和MDAMB-231細胞經(jīng)槐耳誘導的凋亡減少。細胞凋亡與MMP降低有關(guān)(26)；因此我們使用羅丹明123測知MMP變化。圖7顯示，與對照組相比，槐耳處理導致MFI時間和劑量依賴性地降低，說明槐耳處理嚴重影響線粒體的功能，從而引起兩種細胞系的細胞凋亡?；倍幚砗蟮募毎芷诓东@和細胞凋亡機制因為p53活化導致細胞周期阻滯和DNA修復或細胞凋亡，我們通過蛋白印記試驗對p53和磷酸化p53 (p-p53)的表達進行了檢測。如圖8a所示，p53和p-p53的表達時間和劑量依賴性地上調(diào)，表明槐耳的處理可以影響MCF-7細胞中的p53聚集和活化。Channels (FL2-A) 通路（FL2-A

28、）Number 數(shù)量Percentage of cells 細胞百分比Con 對照圖5 .槐耳可以抑制細胞周期在G0G1 的反應，(a)槐耳誘導 MCF-7細胞G0G1的阻滯，(b)根據(jù)分布， 通過PI-膜聯(lián)蛋白-V染色進行細胞周期凋亡識別后，最后通過流式細胞分析對MCF-7細胞的細胞周期進行評估由三組獨立的實驗進行對照，得出數(shù)據(jù)是平均 SD，Control 對照物 Huaier (2mg/mL, 24h) 槐耳（2毫克/毫升，24小時）Huaier (4mg/mL, 24h) 槐耳（4毫克/毫升，24小時）Z-VAD + Huaier (2mg/mL, 48h) Z-VAD + 槐耳（2毫克

29、/毫升，48小時）圖6 MCF-7和MDA-MB-231細胞(xbo)經(jīng)槐耳誘導(yudo)凋亡(dio wn)的流式細胞儀PI-膜聯(lián)蛋白-V的量化分析。 (a) 使用0、2和4mg/mL濃度槐耳進行24或48小時處理的MDA-MB-231細胞的點圖。使用2mg/mL濃度槐耳提取物進行48小時處理前1小時，向培養(yǎng)基中添加Z-VAD-fmk。(b) 使用0、4和8mg/mL濃度槐耳進行24或48小時處理的MDA-MB-231細胞的點圖。使用4mg/mL濃度槐耳提取物進行48小時處理前1小時，向培養(yǎng)基中添加Z-VAD-fmk。所顯示結(jié)果代表3次獨立的實驗。表1 PI-膜聯(lián)蛋白-V染色凋亡(dio

30、wn)試驗中的象限分布（QD）百分率QD對照24-224-448-248-4z-vad+48-2MDA-MB-231細胞系ULURLLLR2.620.102.410.3894.710.570.260.110.910.058.180.5287.230.753.670.454.083.408.840.4484.410.613.510.226.780.2110.640.3180.840.771.740.258.451.8714.223.5072.026.255.301.320.431.013.210.2994.470.181.890.13QD對照24-424-848-448-8z-vad+48-4_

31、 _ _ _ _ _ _MCF-7細胞系ULURLLLR0.910.201.490.1993.110.074.490.348.060.7311.892.6375.833.344.231.369.770.6021.470.2563.540.475.220.1814.340.316.470.1778.450.130.750.059.940.1919.280.2565.050.835.730.422.160.172.990.1890.480.114.360.33_3次實驗(shyn)的數(shù)據(jù)均以平均值標準差表示(biosh)。LL Lower Left（左下）；LR Lower Right（右下）；U

32、L Upper Left（左上）；UR Upper Right（右上）。（圖中內(nèi)容）X Mean 平均值 Con 對照 Concentration濃度圖7 通過羅丹明123檢測線粒體膜電位（MMP）分析。使用槐耳提取物進行系列處理后，(a) MDA-MB-231和(b) MCF-7細胞的MMP均時間和劑量依賴性地降低。3次獨立實驗的平均熒光強度顯示在各個圖形中，以平均值 表示。Con指control（對照）。然而在MDA-MB-231細胞中，未觀察到明顯p53聚集和活化（圖8b）。為進一步研究槐耳引起細胞凋亡的機制，通過蛋白印記試驗測定了Bcl-2、BAX、前半胱天冬酶-3和裂解的半胱天冬酶-

33、3的表達。如圖8中所示，MCF-7和MDA-MB-231細胞系分別為BCL-2高表達和低表達細胞系?；倍幚砜蓵r間和劑量依賴性地抑制Bcl-2表達及上調(diào)BAX表達。因此，Bcl-2與BAX的比率下降，引起線粒體介導的細胞凋亡。為評估槐耳誘導凋亡的執(zhí)行通路，我們還通過蛋白印記法對前半胱天冬酶-3和裂解的半胱天冬酶-3進行了測定。如圖8c、d所示，槐耳處理后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的半胱天冬酶活化顯著增強，從而引起裂解的半胱天冬酶-3表達增加，而前半胱天冬酶-3的表達降低。討論最近，中藥已成為開發(fā)新藥的豐富的資源，越來越多的中藥被發(fā)現(xiàn)能夠誘導細胞凋亡(27)。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)

34、槐耳水提物能抑制細胞的活力和移動能力，并且還引起細胞形態(tài)變化。MTT試驗表明，這種活力抑制作用表現(xiàn)為時間和劑量依賴性的方式?；倍鷮DA-MB-231的細胞毒性作用比對MCF-7細胞的毒性更為明顯。另外，經(jīng)過槐耳處理后，可以觀察到一些典型的形態(tài)變化，說明發(fā)生了細胞損傷。我們得出的結(jié)果還證實，槐耳作為誘導物，可通過p53活化于MCF-7細胞中引起G0G1期阻滯，但MDA-MB-231細胞中未觀察到這種作用。p53腫瘤抑制蛋白可以影響細胞在對DNA損傷及其它基因組異常的的反應。p53活化可導致細胞周期阻滯或細胞凋亡。磷酸化p53是p53活化形式之一(28)。鑒于MCF-7中的p53為野生型，其p5

35、3和p-p53的上調(diào)可以引起細胞周期的阻滯。然而，在MDA-MB-231細胞中， p53處于突變型且功能異常(29)。一般來說，乳腺癌細胞可根據(jù)其雌激素受體（ER）狀態(tài)分為兩類，MCF-7細胞系呈ER陽性，而MDA-MB-231細胞系呈ER陰性(30)。ER陽性的乳腺癌細胞系通常預后更好(31)，而目前近三分之一的乳腺癌呈ER陰性，預后較差(32)。MDA-MA-231細胞被認為是中度侵襲性的，而MCF-7細胞被視為一種非侵襲性細胞(24)。因此，重要的是要找到對ER陽性和ER陰性乳腺癌均起作用的新藥。令人欣慰的是，PI-膜聯(lián)蛋白-V染色試驗和蛋白印記分析證實了半胱天冬酶在兩種細胞系中均可以執(zhí)

36、行細胞凋亡。一些抗癌藥物誘導的凋亡構(gòu)成治療效果的一個重要方面。誘導過程中所涉及的兩個重要途徑已得到深入研究。一個通路是死亡受體途徑，另一個是線粒體途徑；后者被視為介導哺乳動物細胞凋亡的重要途徑。我們在MMP實驗中得出的結(jié)果同樣證實槐耳誘導凋亡的MMP下降。-actin -肌動蛋白 Control 對照caspase-3 半胱天冬酶-3 Cleavaged caspase-3裂開的半胱天冬酶-3圖8 槐耳提取物對p53、磷酸化p53 (p-p53)、Bcl-2、BCL2相關(guān)X蛋白（BAX）以及(yj)半胱天冬酶-3蛋白表達的影響。-肌動蛋白的表達(biod)作為(zuwi)內(nèi)參。(a,c) MC

37、F-7細胞和(b,d) MDA-MB-231細胞以4毫克/毫升濃度處理24或48小時，以及以8毫克/毫升濃度處理24或48小時。各種蛋白的表達均被量化為光密度值，并通過ImageJ進行分析。(e) MCF-7和MDA-MB-231細胞中Bcl-2的不同表達。顯示的數(shù)值代表了三次獨立的實驗。在線粒體途徑中，Bcl-2家族成員負責對不同情況下的細胞凋亡進行調(diào)節(jié)，包括抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡BAX蛋白(33)。關(guān)于本研究中使用的兩種代表性的細胞系，ER陽性MCF-7細胞中Bcl-2表達水平高，但在ER陰性MDA-MB-231細胞中，Bcl-2表達水平很低。這個結(jié)果與過去的眼界結(jié)果一致(34)，并

38、被證實，Bcl-2表達呈現(xiàn)與ER狀態(tài)的正相關(guān)性(35)。另外，相同處理后兩種細胞系之間存在活力差別的原因亦不難推斷，因為ER陽性細胞具有過表達的抗凋亡Bcl-2蛋白，這賦予了其抗藥性(3638)。考慮到槐耳水提物作為一種乳腺癌治療輔助藥物可起到一種奇特的作用，尤其對于三陰及晚期乳腺癌，將來的研究需針對其抗癌的機制。另外，我們還應考慮槐耳提取物與化療、內(nèi)分泌療法以及放療等常規(guī)傳統(tǒng)療法之間的相互作用。綜上所述，我們的結(jié)果表明，槐耳提取物可通過誘導乳腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯而抑制細胞增殖。這些結(jié)果有助于理解槐耳的抗癌活性。最近，包含槐耳提取物進行乳腺癌組合治療的研究已在進行之中，我們熱切期待臨床試

39、驗的結(jié)果。致謝本項目獲得以下部分資助：新世紀優(yōu)秀人才支持計劃、教育部科學技術(shù)研究重點項目（編號108080）、國家自然科學基金（編號30772133）以及山東大學自主創(chuàng)新基金（由Yang Qifeng教授獲得）（IIFSDU，編號2009JQ007）。我們在此感謝以下人員所給予的技術(shù)支持及意見和建議。披露(p l)聲明作者(zuzh)無利益沖突。參考文獻1 Coughlin SS, Ekwueme DU. Breast cancer as a global health concern. Cancer. Epidemiol 2009; 33: 3158.2 Breast cancer in d

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