電子教案與課件：生化分離原理與技術(shù)-6-單元融合及創(chuàng)新

1、第七章 單元融合及創(chuàng)新江南大學(xué)生物工程學(xué)院第三篇 分離技術(shù)的融合與集成融合和創(chuàng)新在基本分離技術(shù)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生為更高效的應(yīng)用服務(wù)OR為新穎而創(chuàng)新？生物分離技術(shù)：技術(shù)和藝術(shù)的結(jié)合集成指為達(dá)到某一目標(biāo)，組合分離技術(shù)，形成高效工藝有效設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證回顧生物物料的預(yù)處理離心過濾細(xì)胞破碎沉淀技術(shù)萃取技術(shù)膜分離技術(shù)層析技術(shù)電泳技術(shù)蒸發(fā)和干燥技術(shù)上游設(shè)計(jì)催化轉(zhuǎn)化變性復(fù)性檢測和評價(jià)方法第七章 單元融合及創(chuàng)新概述親和沉淀技術(shù)膜層析技術(shù)與雙水相集成的分離技術(shù)混合模式吸附層析擴(kuò)張床吸附層析概述單元融合分離技術(shù)是指把兩種或兩種以上的分離技術(shù)合成為一種更有效的分離技術(shù)目標(biāo)：提升分離效率、提高產(chǎn)品收率、降低過程成本不經(jīng)意間離

2、心過濾技術(shù)等電點(diǎn)下的鹽析超臨界流體色譜技術(shù)。親和沉淀（Affinity precipitation）：是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。是蛋白質(zhì)類生物大分子相互親和作用與沉淀分離相結(jié)合的分離純化技術(shù)。一 親和沉淀技術(shù)常用的親和作用體系體系類型配基目標(biāo)配體高特異性體系酶酶抑制劑、酶底物類似物、輔助因子抗原抗體核酸互補(bǔ)堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶荷爾蒙受體、載體蛋白群特異性體系凝集素多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞過渡金屬離子蛋白質(zhì)酶蛋白A、G抗體肝素脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、凝血蛋白、抗凝血酶

3、三嗪類色素脫氫酶激酶、血清白蛋白、干擾素、核酸酶、糖解酶回顧：親和對可逆溶解性聚合物（SIS聚合物）可逆溶解性聚合物: Reversibly Soluble Polymers(RS聚合物)；或稱為Soluble and Insoluble Polymers(SIS聚合物)這類聚合物的溶解與非溶解狀態(tài)可隨環(huán)境參數(shù)如pH、溫度等的變化而發(fā)生可逆變化，因此可被用于酶與蛋白質(zhì)的親和沉淀或可逆固定化分離過程一定條件下就可形成沉淀，通過過濾或離心的方式進(jìn)行分離，然后將酶或蛋白從親和配體一SIS聚合物上解離下來?；旌?親和吸附-改變條件沉淀-離心或過濾-解離-離心1、帶同種電荷的多聚電解質(zhì)。通過靜電親和作用

4、形成SIS聚合物一蛋白質(zhì)共聚物。類型2、帶親和配基的多聚化合物。專一性更強(qiáng)的親和 形成SIS聚合物一親和配體一靶蛋白的共聚物。例1：利用聚合脂質(zhì)體的沉淀可逆性固定STI及其PL-STI對胰蛋白酶的親和作用 通過雙功能試劑戊二醛、二甘醇二酸酐和1,4-丁二醇雙縮水甘油醚等將大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）固定到由二十五-10,12-二炔-1-醇磷脂乙醇胺形成的聚合脂質(zhì)體（PL）上 沉淀?xiàng)l件：0.14-0.25M的鹽（NaCl、KCl、NH4SO4等） 胰蛋白酶收率20%60%，PL-STI 可作為酶的親和沉淀吸附劑。 親和配基偶聯(lián)到聚合物的過程例2：殼聚糖親和沉淀殼聚糖：酸溶、堿沉淀，離子交換作用p

5、H6.5以下溶解態(tài)，pH6.9與雜蛋白形成沉淀殼聚糖親和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25 柱層析三步法分離純化藻藍(lán)蛋白殼聚糖和活性炭結(jié)合使用，可使藻藍(lán)蛋白純度( A620 /A280 ) 由0.93提高至2.78。通過DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠柱層析后，可得到高純度藻藍(lán)蛋白，純度達(dá)4.3。涉及到的基礎(chǔ)技術(shù)： 膜分離技術(shù) 層析技術(shù)二 膜層析技術(shù)介質(zhì)剛性不夠、易被壓縮，難以獲得較高的處理速度，也不易進(jìn)行線性放大；床層內(nèi)易產(chǎn)生溝流，傳質(zhì)效果較差；配基價(jià)格昂貴卻不能充分利用，只有1%-2%的配基與蛋白質(zhì)結(jié)合；吸附柱易堵塞和污染，往往只適用于間歇操作，處理量相對

6、較低，操作時(shí)間較長。傳統(tǒng)的液相層析的缺點(diǎn)傳統(tǒng)的膜分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)分離速度快、操作壓力低、無相變、能耗低、易于放大和連續(xù)操作、基質(zhì)來源廣泛且價(jià)格相對較低等優(yōu)點(diǎn)靠篩分機(jī)理分離，對目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)大小相近的混合物分離顯得無能為力膜層析技術(shù)將對生物大分子有特異性和選擇性的功能基團(tuán)連接到膜的表面及孔壁中去，從而制備一種新型的層析介質(zhì)，稱為膜層析介質(zhì)（或稱為膜吸附劑），利用膜對物料的篩分和功能基團(tuán)的作用進(jìn)行的分離技術(shù)稱為膜層析技術(shù)膜層析技術(shù)是液相層析和膜分離相結(jié)合的一種新技術(shù)，融合了二者之長具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點(diǎn)滿足一般情況或者特殊情況下生物大分子高效分離與純化的需要采用具有一定孔徑的膜作

7、為介質(zhì)，連接配基，利用膜配基與蛋白質(zhì)等目標(biāo)分子之間的相互作用進(jìn)行分離純化當(dāng)料液以一定流速流過膜的時(shí)候，目標(biāo)分子與膜介質(zhì)表面或膜孔內(nèi)基團(tuán)特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則透過膜孔流出，待處理結(jié)束后再通過洗脫液將目標(biāo)分子洗脫下來，其純化倍數(shù)可達(dá)數(shù)百乃至上千倍原理與普通的膜技術(shù)相比： 不僅利用膜孔徑的大小，更主要的是利用其特異性和選擇性，不受相對分子質(zhì)量大小的限制特點(diǎn)與液相層析技術(shù)相比： 由于在膜孔基質(zhì)上配基與液流之間擴(kuò)散路徑極短，傳質(zhì)極快，分離時(shí)間顯著縮短，分離效率提高； 由于膜的空隙率大，其孔表面積很高，膜的厚度很薄就能滿足分離要求，造成液流通過膜的壓力降低； 由于膜的元件都是標(biāo)準(zhǔn)的，膜層析等集成技術(shù)易于放大

8、，便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)分離和自動操作。特點(diǎn)（1）親和膜分離兩個(gè)分支：親和膜分離技術(shù)，制備帶有親和配基的分離膜，直接進(jìn)行產(chǎn)物分離；親和錯(cuò)流膜過濾，將水溶性或非水溶性高分子親和載體與產(chǎn)物進(jìn)行特異反應(yīng)，然后用膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾。親和膜分離技術(shù)（一般意義）親和膜分離(Afinity Membrane Separation)是將親和層析與膜分離技術(shù)結(jié)合起來以提高過程選擇性的一項(xiàng)新型分離技術(shù)。親和膜技術(shù)的研究始于20世紀(jì)中期，自1991年Klein的親和膜(Affinity Membrane)專著出版以來，促進(jìn)了對親和膜技術(shù)的研究，在基膜材料改性、親和配基偶聯(lián)、親和膜組件設(shè)計(jì)、過程動力學(xué)以及親和膜應(yīng)用方面都有了

9、較大的發(fā)展，但還有許多問題有待進(jìn)一步深人研究。親和膜分離示意親和膜制備即通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)，在膜表面接上可反應(yīng)的官能團(tuán)或者是一定長度的“間隔臂”選用一個(gè)適合的親和配基(Ligand)，在一定條件下讓其與間隔臂分子產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合，生成帶有親和配基的膜分離介質(zhì)。常用的親和膜載體材料脂族烴類(聚乙烯、聚丙烯)芳香族共聚物(聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜)脂族聚酰胺(尼龍6、尼龍66)以及一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇、纖維素。親和配基（1）特異性配基：只與其對應(yīng)的分子發(fā)生特異性結(jié)合，如抗原、抗體、抑制劑、激素、激素受體等;（2）通用型配基：能與某一類物質(zhì)結(jié)合，如三嗪類染料活性染料（輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NA

10、D+ )類似物）能與許多需要這種輔酶的酶結(jié)合親和分離需解決的幾個(gè)關(guān)鍵問題 膜表面要有足夠多并可利用的化學(xué)基團(tuán)(一般為一OH基)，使其能進(jìn)行活化，接上合適的間隔臂和配基。要有足夠數(shù)量可利用的化學(xué)基團(tuán)則必需有足夠高的表面積，以便于讓生物大分子自由地出入膜，必需有足夠大的孔徑。孔分布應(yīng)窄而均勻，以獲得高的通適量和分離效能。為了實(shí)現(xiàn)快速分離，常要加壓操作，因此要求膜有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能承受力，長期使用不變形。親和膜要耐酸、耐堿、耐高濃度的緩沖浪和有機(jī)溶劑。操作方式親和超濾親和微濾親和超濾分離目標(biāo)物的同時(shí)，濃縮其他成分親和微濾僅分離目標(biāo)物親和-膜過濾 (Affinity filtration) ，是19

11、81年由Hedda等人首先提出并得到迅速發(fā)展的一種新型大規(guī)模分離純處技術(shù)。既充分利用了載體上的配基對目標(biāo)組分的專一的可逆的親和吸附作用和超濾膜分離易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，又克服了超濾膜分離技術(shù)對分子質(zhì)量相近的大分子無法實(shí)現(xiàn)分離的缺點(diǎn)親和-膜過濾（狹義上）示意圖1示意圖2親和-膜過濾過程及其關(guān)鍵問題親和載體：親和載體的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)由對生物分子無特異吸附性的物質(zhì)組成的內(nèi)核以及內(nèi)核表面上連接的某些特定基團(tuán)，這些基團(tuán)必須對所提取的蛋白質(zhì)有一定的特異吸附性。分類：水溶性大分子載體水不溶性微載體水溶性大分子載體 優(yōu)點(diǎn):親和載體與目標(biāo)蛋白在均相體系中反應(yīng)速率快,達(dá)到吸附或洗脫平衡的時(shí)間極短,吸附容量大水不

12、溶性微載體 非水溶性載體的種類較多,據(jù)報(bào)道可用的非水溶性基質(zhì)有各種菌類的完整細(xì)胞(酵母、芽孢桿菌、鏈球菌等細(xì)胞)、納米硅石微粒、瓊脂糖、凝膠、脂質(zhì)體等也均被作為基質(zhì)使用過。親和載體與目標(biāo)分子的結(jié)合在親和-膜過濾過程中,親和載體與目標(biāo)分子之間的結(jié)合可能存在弱的共價(jià)鍵、離子鍵、分子鍵和配位鍵的作用。親和-膜過濾應(yīng)用親和- 膜過濾技術(shù)應(yīng)用在分離和純化蛋白質(zhì)、酶方面已經(jīng)有很多成功的例子。朱家文等用DextranT2000 ，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)并氧化產(chǎn)生部分羧基，偶聯(lián)對氨基苯甲脒制得水溶性親和載體，來純化的尿激酶。孫彥等研究了脂質(zhì)體的制備，并利用對氨基苯甲脒修飾的脂質(zhì)體有效地純化了胰蛋白酶。親和膜過濾純化

13、伴刀豆蛋白A的實(shí)驗(yàn)裝置熱殺死酵母細(xì)胞作為載體截?cái)嘞鄬Ψ肿恿?106隨著生物醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展,生物醫(yī)藥的分離純化成為一個(gè)研究熱點(diǎn),親和-超濾膜分離技術(shù)在手性藥物、抗生素等的分離與純化方面得到了一定程度的應(yīng)用。例如：以D-丙氨酰-丙胺酸為配基連接到水溶性的聚合物葡聚糖上,將其作為親和載體來分離糖肽抗生素-萬古霉素。離子交換膜是膜狀的離子交換樹脂。離子交換膜包括三個(gè)基本組成部分：高分子骨架，固定基團(tuán)可交換離子（反離子）（2）離子交換膜層析（IMC）原理離子交換膜層析主要是利用膜介質(zhì)表面的離子交換基團(tuán)與目標(biāo)蛋白之間的離子交換作用進(jìn)行分離的。根據(jù)離子交換基團(tuán)的性質(zhì)，可分為強(qiáng)陽離子型、弱陽離子型、強(qiáng)陰離子型

14、、弱陰離子型。由商用膜改性制得的膜介質(zhì)，其成本相對較低。在流速較慢的情況下，還可通過梯度洗脫分離蛋白質(zhì)的混合物。離子交換膜層析由于操作條件較溫和，可以有效地保持蛋白質(zhì)的活性，并可延長膜的使用壽命，其缺點(diǎn)是選擇性較差。與電滲析相區(qū)別共性：均使用離子交換膜區(qū)別： 離子交換膜層析：超濾或者微濾方式 電滲析：離子選擇透過離子交換膜為主要特征，納濾或者反滲透膜為主按電荷分:陽離子交換膜：活性基團(tuán)：磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）砷酸基（AsO32-）等；陰離子交換膜：活性基團(tuán)：伯、仲、叔、季胺基（脂肪胺與芳香胺）-NH3+、 -RNH2+、 -R2NH+、-R3N+按膜結(jié)構(gòu)

15、劃分: 異相膜半均相膜均相膜目標(biāo)分子膜介質(zhì)配基人尿激肽釋放酶纖維素膜N（CH3）3人腫瘤壞死因子GMA季胺基寡聚核苷酸GMA-EDMADEAE免疫毒素改性纖維素CM溶菌酶GMASO3H-Mg凝血酶原纖維素膜DEAE卵白蛋白、人血清白蛋白、胰島素抑制劑甲殼素膜EGDEBSA交聯(lián)改性纖維素磺酸基乳清蛋白交聯(lián)改性纖維素磺酸基、季胺基離子交換膜層析的應(yīng)用研究實(shí)例例：IMC純化DNA質(zhì)粒和肽鏈等生物分子采用甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）為基質(zhì)，二乙氨乙基(DEAE)為離子交換基團(tuán)，在5mL/min的流速下有效地分離了四種寡聚核苷酸(長度分別為8，10，12和14個(gè)核苷酸)。還在同樣的基質(zhì)接上-SO3-基

16、團(tuán)后，用于肽鏈的分離。例：蛋清中分離溶菌酶通過射線引發(fā)接枝獲得甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA膜，先在中空纖維膜上接入環(huán)氧基團(tuán)，然后通過亞硫酸鈉接入SO3H基團(tuán)，再與鎂離子交聯(lián)，制成離子交換膜介質(zhì)，膜的蛋白質(zhì)平衡容量可達(dá)到0.42g/g以NaHCO3-NaOH緩沖液為洗脫液，在pH為9.0時(shí)洗脫率達(dá)到100%。由于膜上螯合了Mg2+，使得膜的透過速率也有較大增加。例：人凝血酶原分離采用纖維素膜共價(jià)連接DEAE的徑向IMC，從血漿的分離物(Nitschmannfrac- tion)中分離人凝血酶原樣品的通過速率為2030mL/min，在不降低分離效率的前提下，洗脫速率達(dá)到40mL/min。這種膜還可用

17、于DNA、多肽和其它蛋白質(zhì)的分離。由于疏水配基結(jié)構(gòu)簡單，通用性好且成本較低，故疏水層析已成為蛋白質(zhì)分離純化的常用技術(shù)之一。但是，目前常用的疏水層析大多采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖等“軟”基質(zhì)，分離速度不夠理想，且不易放大，疏水膜層析就是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。疏水膜層析上的配基，常用的有甲基、丁基、苯基、辛基、己二胺、聚乙二醇等，通過目標(biāo)物質(zhì)與這些配基之間疏水作用的不同而實(shí)現(xiàn)分離。影響疏水膜層析操作情況的主要因素有:鹽離子的種類，離子強(qiáng)度，pH和柱溫等。（3）疏水膜層析目標(biāo)蛋白膜介質(zhì)配基牛肝過氧化氫酶纖維素膜苯基牛血清白蛋白纖維素膜苯基熱原纖維素膜己二胺肌球素、核酸酶、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶十二烷基甲基

18、丙烯酸酯-GMA-EDMA共聚物十二烷基牛血清白蛋白聚乙烯膜苯基人腫瘤壞死因子QuickDisk丁基、苯基疏水膜層析的應(yīng)用研究實(shí)例三 與雙水相集成的分離技術(shù)雙水相萃取技術(shù) 雙水相是由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，當(dāng)聚合物的濃度達(dá)到一定值時(shí)，就不能形成單一的水相，當(dāng)兩種聚合物在排斥力作用下達(dá)到平衡時(shí)，就形成了穩(wěn)定的兩相，兩種聚合物分別位于兩個(gè)互不相溶的兩相中。 體系具有生物相容性生化工程中常用的雙水相體系（1）雙水相萃取與層析技術(shù)結(jié)合在某一種聚合物上衍生一定的功能配基，不但使體系具有雙水相處理量大的特點(diǎn)，而且通過離子交換或親和作用，增大分配系數(shù)。離子交換雙水相親和雙水相等配料發(fā)酵液

19、 親和配基對聚乙二醇4000(PEG4000)的羥基進(jìn)行活化，以亞氨基二乙酸(DA)為螯合劑，制取含有Cu2+的金屬螯合親和配基PEG-DA-Cu(II)，并以PEG和羥丙基淀粉(PES)形成雙水相，用于直接處理含納豆激酶的發(fā)酵液，如圖6.6所示，經(jīng)過兩次分配分離流程后，納豆激酶的總收率為81%，純化倍數(shù)達(dá)到3.52。例1 納豆激酶的雙水相純化例2 PEG-色素/Aquaphase-PPT(一種淀粉的羥丙基衍生物的商品名)系統(tǒng)從豬肌組織中連續(xù)萃取乳酸脫氫酶（LDH）1、豬肌組織直接在成相系統(tǒng)中勻漿，固形物分配在下相，而目標(biāo)產(chǎn)物分配在上相。2、用離心機(jī)分相后，上相用純下相溶液清洗一次，進(jìn)入第二個(gè)

20、離心機(jī)。3、從第二個(gè)離心機(jī)流出的上相與磷酸鈉溶液(50%，pH6.97.0)混合，形成PEG/磷酸鈉雙水相系統(tǒng)。4、由于LDH與色素的親和作用下降，LDH被反萃到下相(磷鈉溶液)中得到回收，而上相的PEG和PEG-色素返回勻漿機(jī)中循環(huán)再利用。將雙水相萃取同生物轉(zhuǎn)化結(jié)合在一起，可解決在許多生物轉(zhuǎn)化中存在的兩個(gè)問題： a) 產(chǎn)物抑制 b) 酶的重復(fù)利用（2）雙水相萃取與生物轉(zhuǎn)化結(jié)合示意圖例1 木質(zhì)素經(jīng)過酶水解生產(chǎn)乙醇Bartlett等實(shí)現(xiàn)了在雙水相系統(tǒng)中-甘露糖苷酶催化糖基轉(zhuǎn)化合成低聚糖。Andersson等研究了在PEG/DEX系統(tǒng)中利用枯草桿菌進(jìn)行流化發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶，比普通發(fā)酵的酶產(chǎn)率提高了

21、63%。其他例子四 混合模式吸附層析混合模式吸附層析（Mixed Mode Chromatography，MMC），又稱多模式層析（Multy Mode Chromatography， MMC ） 包含兩種或兩種以上的作用模式，能夠與目標(biāo)生物分子發(fā)生多種相互作用的層析方法?；旌夏Ｊ轿浇橘|(zhì)上配基的功能往往具有互補(bǔ)性或協(xié)同性，因此它能夠適應(yīng)某種特殊條件下對蛋白質(zhì)的捕獲，或者產(chǎn)生類似于群特異性的親和吸附效果。混合模式吸附技術(shù)發(fā)展歷程 “表面活性劑”型疏水層析離子交換型混合模式層析疏水性電荷誘導(dǎo)層析離子交換型混合模式層析示意和示例離子交換型混合模式層析介質(zhì)配基的結(jié)構(gòu)親硫作用層析20世紀(jì)60年代，Po

22、rath等發(fā)現(xiàn)吸附劑配基中硫原子的重要作用。1985年，Porath等制備“T-gel”，并正式將該層析方法稱為親硫作用層析（thiophilic interaction chromatography，TIC）高鹽下吸附，低鹽下洗脫但是與HIC不同的是，“T-gel”配基具有很好的親水性，對蛋白質(zhì)的吸附并不是單純依靠疏水作用。此外，親硫?qū)游鼋橘|(zhì)對抗體有特異的選擇性，但對血清蛋白等吸附作用很弱 疏水性電荷誘導(dǎo)層析(hydrophobic charge induction chromatography, HCIC )1998年首次由Burton和Harding 提出典型HCIC介質(zhì)（MEP Hyp

23、erCel）和吸附洗脫示意：可在含一定量的鹽或者無鹽下吸附,具有Salt-independent配基密度若40 mmol/ml ，則無吸附與免疫球蛋白的保守區(qū)中的Trp、Phe等殘基有特異性吸附,主要用于抗體的分離，代替Protein A配基pH主導(dǎo)的HCIC介質(zhì)與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理pH5pH7pH12pH4pH2介質(zhì)配基目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)物來源MEP HyperCelMEP單抗CHO細(xì)胞懸浮液MEP HyperCelMEP單抗小鼠腹水MEP HyperCelMEP單抗山羊奶MEP HyperCelMEP多抗兔血清MEP HyperCelMEP多抗兔血清MEP-SepharoseMEP類風(fēng)濕因子、抗雙鏈

24、DNA抗體人血清MEP HyperCelMEPFc融合蛋白混合溶液MEP HyperCelMEP單抗和Fc融合蛋白CHO細(xì)胞MEP HyperCelMEP唾液蛋白唾液MEP HyperCelMEP前列腺特異性抗原精漿MEP HyperCelMEP重組肉毒桿菌神經(jīng)毒素片斷畢赤酵母MEP HyperCelMEP青霉素?；D(zhuǎn)移酶大腸桿菌HCIC的應(yīng)用例子Protein A親和介質(zhì)：目前最為常用的抗體親和層析介質(zhì)，曾占到所有抗體純化工藝的70-80%，其局限性：1）Protein A親和介質(zhì)十分昂貴，是常規(guī)層析介質(zhì)的10倍左右；2）介質(zhì)再生困難，重復(fù)使用次數(shù)有限；3）抗體吸附容量不高；4）Protei

25、n A配基易脫落，來源于細(xì)菌表面的毒素，影響分離效果和產(chǎn)品質(zhì)量；5）需要低pH洗脫（pH 3左右），易造成抗體聚集；6）Protein A-抗體的親和力過強(qiáng)，容易引起抗體結(jié)構(gòu)的變異?！胺掠H和”的HCIC介質(zhì)：）化學(xué)配基價(jià)格相對便宜，與常規(guī)層析介質(zhì)相當(dāng)；）配基穩(wěn)定，再生容易，可多次重復(fù)使用；）MEP HyperCel的洗脫pH在4左右，且添加精氨酸等物質(zhì)可在中性條件下實(shí)現(xiàn)洗脫；）親和力適中，不易引起抗體結(jié)構(gòu)變異。）目前，靜態(tài)吸附較Protein A高，但動態(tài)吸附相對較低；HCIC與傳統(tǒng)Protein A親和對比相同點(diǎn)：通過親和作用與抗體的Fc片段特異性結(jié)合，減低溶液pH實(shí)現(xiàn)洗脫。不同點(diǎn)：VS五

26、擴(kuò)張床吸附層析擴(kuò)張床吸附層析（Expanded Bed Adsorpation, EBA）是一種新型的層析操作方式，即結(jié)合了傳統(tǒng)的流化床（Fluidized Bed）的進(jìn)料方式，又接近于固定床（Packed Bed）的層析性能，可能看成是一種新型的集成分離技術(shù)特點(diǎn)用途：集成化擴(kuò)張床、流化床和固定床的比較操作方式操作原理能否處理含顆粒的料液上樣方式吸附效率優(yōu)缺點(diǎn)擴(kuò)張床料液接近平推流通過床層，返混小能自下而上好需特制的介質(zhì)和裝置流化床料液和介質(zhì)充分混合，返混大能自下而上不好為達(dá)到一定吸附率，需循環(huán)上樣固定床流體以平推流通過床層不能自上而下好確證可行，已廣泛工業(yè)化擴(kuò)張床床層基質(zhì)的特性密度、粒徑及其分

27、布和結(jié)構(gòu)組成基質(zhì)的結(jié)構(gòu)A，核殼型；B，混合型；C，均一型商品擴(kuò)張床介質(zhì)介質(zhì)生產(chǎn)公司組成和類型密度g/ml粒徑,m/平均粒徑,m功能基團(tuán)StreamlineAmersham Biosciences瓊脂糖-石英砂核殼型基質(zhì)1.2100300/200DEAE, Q, SP, CM, Chelating, Phenyl, Heparin, rProtein AStreamlineDirect HST IAmersham Biosciences瓊脂糖-不銹鋼混合型基質(zhì)1.880165 /130混合模式UpfrontFastline ProUpfrontChromatographyA/S瓊脂糖-碳化鎢混合

28、型基質(zhì)2.53.520200離子交換、混合模式HyperzPALL凝膠-氧化鋯“Gel in shell”3.240105 /75離子交換擴(kuò)張床吸附技術(shù)的操作(1) 平衡 擴(kuò)張床在每次吸附操作前需用平衡緩沖液擴(kuò)張，讓擴(kuò)張床擴(kuò)張到一定程度，并使其達(dá)到平衡。在此階段，基質(zhì)的功能基團(tuán)亦達(dá)到平衡。在擴(kuò)張過程中，需要確定一個(gè)合適的擴(kuò)張率E（定義為擴(kuò)張床床層高度H與沉降床高度H0之比）。擴(kuò)張率太低，會使料液中的固體顆粒通過困難，造成局部堵塞；擴(kuò)張率過高，流速太大，會導(dǎo)致液相返混增加，吸附效率降低。一般認(rèn)為，擴(kuò)張床吸附層析操作的合適擴(kuò)張率為23。另外，維持一個(gè)最低的沉降床高度，對消除進(jìn)口處不均勻流化的影響，

29、獲得穩(wěn)定的、返混程度小的床層十分重要，床層穩(wěn)定時(shí)理論塔板數(shù)一般為170200 N/m，軸向混合系數(shù)在10-6m2/s數(shù)量級。(2) 吸附 待平衡操作結(jié)束后，迅速將進(jìn)樣口由平衡緩沖液切換成料液，開始上樣吸附。由于原料液的粘度和密度一般要高于平衡緩沖液，若維持上樣流速不變，床層高度就會增加。因此，為保持?jǐn)U張率不變，需要降低流速；而在吸附過程后期，由于吸附了目標(biāo)產(chǎn)物和一些雜質(zhì)，基質(zhì)顆粒的密度有所增加，此時(shí)需要增加流速來維持原來的擴(kuò)張率。也可以維持不變、根據(jù)擴(kuò)張高度的變化來調(diào)節(jié)上分布器的位置。Chang等對這兩種操作方式作了比較，認(rèn)為前一種方式較佳，可以獲得較高的動態(tài)吸附容量。(3) 清洗 吸附操作結(jié)

30、束以后，介質(zhì)內(nèi)外不可避免地殘留了部分料液和雜質(zhì)，因此在對目標(biāo)產(chǎn)物洗脫前，需先進(jìn)行清洗操作。清洗一般仍采用擴(kuò)張床方式，維持上樣時(shí)的流速不變。清洗液可使用平衡緩沖液或高粘度緩沖液。采用后者可以減少清洗液的用量，同時(shí)保證清洗液以更接近于平推流的方式流過床層，獲得更好的清洗效果。(4) 洗脫 洗脫是層析過程的關(guān)鍵步驟。擴(kuò)張床層析過程有兩種洗脫方式，即固定床方式（自上而下）和擴(kuò)張床方式（自下而上）。如果介質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)物之間的結(jié)合力較弱，產(chǎn)物主要吸附在床層的下半部分，應(yīng)采用固定床方式洗脫；如果介質(zhì)的吸附容量已經(jīng)達(dá)到飽和，產(chǎn)物相對均勻地分布于整個(gè)床層之中，則采用擴(kuò)張床洗脫方式更為有效。兩種洗脫方式各具特色，采

31、用固定床方式不僅可以減少洗脫液的用量，增加產(chǎn)物的濃度，還可以避免目標(biāo)產(chǎn)物的過度稀釋，但缺點(diǎn)是洗脫時(shí)間長，操作過程復(fù)雜，介質(zhì)顆粒會聚集，影響其再度擴(kuò)張；而采用擴(kuò)張床洗脫方式的優(yōu)點(diǎn)是過程簡單，操作方便、迅速，不會造成介質(zhì)的聚集，設(shè)備簡單，有利于工業(yè)化控制，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作。(5) 再生 再生必須在洗脫之后馬上進(jìn)行，是必不可少的一環(huán)。擴(kuò)張床介質(zhì)比傳統(tǒng)的固定床介質(zhì)更容易遭到細(xì)胞、細(xì)胞碎片、脂類、核酸等雜質(zhì)的污染，這往往引起吸附容量的降低和介質(zhì)顆粒之間的聚集，使介質(zhì)的流體動力學(xué)特性和吸附性能的重復(fù)性不佳。再生操作首先由配基性質(zhì)而定，與固定床介質(zhì)的再生方式基本相同；其次根據(jù)擴(kuò)張床介質(zhì)的基球性質(zhì)，需避免對

32、基球結(jié)構(gòu)和材料的破壞。一般商品介質(zhì)給出了最優(yōu)的再生方案擴(kuò)張床吸附技術(shù)的應(yīng)用目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)物來源吸附劑收率純化倍數(shù)納豆激酶枯草桿菌Streamline SP93%8.7-乳清蛋白脫脂牛奶Streamline Phenyl人Fab片斷重組大腸桿菌Red Fastmabs90%8.7融合蛋白重組大腸桿菌Streamline SP7080%100GST-(His)6重組大腸桿菌Streamline Chelating80%3.3乳酸脫氫酶豬肉漿Cibacron Blue Celbeads100%31Kinesin-(His) 6重組大腸桿菌Streamline Chelating100%-半乳糖苷酶重組大腸桿菌Streamline Chelating86%6人纖維生長因子重組大腸桿菌Streamline SP87%17人表皮生長因子重組大腸桿菌Strea