共軛焦顯微鏡簡介-60頁PPT課件

1、共軛焦顯微鏡簡介Confocal microscopy 八組王玉興 郭少雄 程飛 張志強 宋百江共軛焦顯微鏡共焦顯微術(shù)的形成與發(fā)展共焦顯微術(shù)的原理共焦顯微鏡的分類共焦顯微鏡的關(guān)鍵技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡的應用 共軛焦顯微鏡共軛焦顯微技術(shù)形成：1953年美國學者馬文明斯基提出。發(fā)展：隨后，P.Davidovits, A.f.Slomba和C.J.R.Sheppard等多位學者對共焦成像進行了更細致的研究 ，越來越多的基于共焦原理的顯微術(shù)被開發(fā)出來 。 直到70年代才有真正實用的共焦顯微鏡問世 。 80年代中期才有商品機型出售。 九十年代以來隨著計算機圖像處理技術(shù)的發(fā)展，共焦顯微術(shù)三維

2、層析能力的優(yōu)點也逐漸凸現(xiàn)出來，受到越來越多研究人員的重視。 近幾年對共焦顯微術(shù)的研究已形成了一個世界性的熱潮 ，人們已經(jīng)研制出了多種多樣的共焦顯微鏡。共焦顯微術(shù)原理共焦：從一個點光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。 共焦顯微術(shù)原理共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡（dichroic mirror），將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點上有一個帶有針孔（Pinhole），小孔就位于焦點處，擋板后面是一個光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）。 激光器擴光器樣

3、品濾光片針孔檢測器入射光發(fā)射光長通濾光片 共軛焦顯微鏡共焦顯微術(shù)原理共焦顯微術(shù)的基本原理如圖所示。共焦顯微鏡分為反射式與透射式兩種形式。點光源發(fā)出的光經(jīng)物鏡后聚焦到物體的表面，再由物體反射或透射后經(jīng)聚光鏡再聚焦到探測器。 共焦顯微術(shù)原理共焦顯微術(shù)的基本原理如圖所示。共焦顯微鏡分為反射式與透射式兩種形式。點光源發(fā)出的光經(jīng)物鏡后聚焦到物體的表面，再由物體反射或透射后經(jīng)聚光鏡再聚焦到探測器。 共焦顯微術(shù)原理優(yōu)點：具有高分辨率尤其是縱向高分辨率的 特點 ，使得它可以對樣品的軸向進行光學 層析，從而可以重構(gòu)出樣品的三維圖像。 原因：探測器前面放置了小孔光闌，使得雜散光被大大消除，而且小孔位于聚光鏡的焦點

4、處，非物鏡焦平面上的光線被擋住，這樣探測器的信噪比就大大提高，成像有很高的對比度和清晰度。 共軛焦顯微鏡的分類商業(yè)化的共聚焦（共軛焦顯）顯微鏡（Confocal microscope）分三類：共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM，LSCM）（點掃描激光共焦顯微鏡、線掃描激光共焦顯微鏡、光纖激光共焦顯微鏡）轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscopes）可編程序陣列顯微鏡（Programmable Array Microscopes (PAM)）其他：熒光共焦顯微鏡

5、、共焦干涉顯微鏡、全息共焦顯微鏡、非掃描激光共焦顯微鏡（需做說明） 顯微鏡成像清晰度的決定因素: 1.分辨率2.球差3.色差1、分辨率： 指顯微鏡能將近鄰的兩個質(zhì)點分辨清楚的能力,通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點間的距離來表示。人眼及各類顯微鏡的分辨率人眼分辨率： 0.20 mm光學顯微鏡分辨率： 0.25 mm共焦顯微鏡分辨率： 0.18 mm電子顯微鏡分辨率： 0.20 nm2、球差： 是由于透鏡不能把近軸光線和遠軸光線在光軸上共聚焦，以至透過標本一點的光線，在通過透鏡時不能聚焦成一點,而是形成一個光斑,從而使成像模糊不清。3、色差： 是由于顯微鏡透鏡類似于三棱鏡,對不同顏色的光線

6、具有不同的折射率。所以光線透過透鏡后,不同色的光聚焦在不同點上,從而使成像模糊,而且像的邊緣尚帶有色暈。共焦顯微鏡的幾個關(guān)鍵技術(shù) 共焦小孔光闌大小的選擇 ：當小孔的直徑等于艾利斑大小時既能保證共焦成像的高分辨率和層析能力，又有足夠的光能通過小孔被探測器接收。 高精度掃描系統(tǒng)的設(shè)計：目前主要采用的 掃描方式主要有以下幾種：（1）機械式工作臺掃描 2）光束掃描（3）Nipkow盤掃描4）光學掃描 光學層析與圖像重構(gòu)算法：由探測器探測到的共焦信號是樣品某個層面的反射光，通過改變聚焦深度即可以獲得不同斷層的光強信息，然后信號經(jīng)過A/D轉(zhuǎn)換變?yōu)閿?shù)字量，以一定的圖像格式存儲到計算機中。每個斷層的平面圖像要

7、經(jīng)過圖像平滑、圖像增強等預期處理達到可進行三維重構(gòu)的要求，再經(jīng)過三維重構(gòu)算法將各斷層二維圖像重構(gòu)成三維圖像。激光掃描共焦顯微鏡共聚焦掃描顯微鏡的系統(tǒng)組成硬件： 激光源 共聚焦顯微鏡 步近器 檢測器 光電倍增管 計算機 圖象輸出設(shè)備（顯示器 彩色打印機）。軟件： 顯微鏡自動控制和掃描系統(tǒng)、圖像處理和分析系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡構(gòu)成激光器光電倍增管檢測器顯微鏡步近器計算機電子圖像軟件激光掃描共焦顯微鏡共聚焦顯微鏡的特點光源共聚焦技術(shù)點掃描技術(shù)信號放大 電子圖像軟件1、光源：激光 用激光做光源，從理論上消除了色差。因為激光的單色性強、光源波束集中、波長相同。2、采用了共扼聚焦技術(shù) 在物鏡的焦平面上放置了

8、一個小孔，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差。3、點與面掃描技術(shù) 共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點，用十分細小的激光束（點光源）逐點逐行掃瞄、成像，通過計算機軟件組合，最后得到一個整體平面的或立體的像。 普通光鏡：是在可見光源下一次性成像。 4、圖像信號及處理：光電倍增管放大信號，計算機采集和處理光信號。 計算機代替了人眼或照相機進行觀察、攝像，得到的圖象是數(shù)字化的，可以在電腦中進行處理，再一次提高圖象的清晰度。共扼聚焦原理圖普通光學顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2. 具有更高的軸向分辨率，

9、并可獲取連續(xù)光學切片激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率4. 由于點對點掃描去除了雜散光的影響激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在結(jié)構(gòu)方面激光做光源，光色純，波長固定，成像效果好，分辨率高，圖象清晰，熒光檢測信噪比高可實現(xiàn)分層掃描可實現(xiàn)連續(xù)掃描，可動態(tài)記錄變化可多根激光管同時掃描，多色熒光同時成像掃描速度快，對樣品損傷小在應用方面形態(tài)觀察-高清晰成像半定量-熒光強度分析熒光探針表達量測定定位研究-分層掃描多種熒光標記同時檢測熒光標記物絕對定量分析擴展應用-如，F(xiàn)RAP法、細胞切割、細胞篩選等激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在效果方面更靈敏： 共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù)，可將很微

10、弱的熒光信號放大。只要有信號就能被檢測到。定位更精確： 不僅可以定位到細胞水平，還可以定位到亞細胞水平、和分子水平。這也是熒光標記的抗體被稱為分子探針的原因。顯微鏡掃激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢定量測量： 靜態(tài)的定量測量 對于不同組的樣品，可以單純比較一種成分，也可以同時比較兩種甚至三種成分。也可以在同一張切片上比較不同成分含量。 動態(tài)的定量測量 共聚焦顯微鏡還能對活細胞內(nèi)的特定成分（如：鈣、鈉、氫等）進行動態(tài)變化測量，并給出動態(tài)變化曲線；還可以同時測量幾種成分，并給出含量比值。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在效果方面 快速性： 由于利用光源光束點掃描，檢測過程快，時間短，計算機精確控制激發(fā)光強度，光漂白和

11、熒光淬滅作用很小。數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存： 用計算機代替了普通的照相機，得到的圖像是數(shù)字化的，不存在暴光方面及膠卷沖洗方面的問題（如熒光太弱，無法暴光；或曝光過程中熒光淬滅等）；而且圖像可進一步加工處理。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在效果方面 牛肺動脈內(nèi)皮細胞 ，微管高清晰成像牛肺動脈內(nèi)皮細胞 ，微管高清晰成像鼠成纖維細胞單克隆anti-tubulin標記 高清晰成像檢測人類癌細胞表皮生長因子高清晰成像培養(yǎng)的293細胞綠色熒光蛋白高清晰成像共聚焦顯微鏡的應用高清晰成像半定量熒光強度分析熒光探針表達量測定分層掃描熒光標記物絕對定量分析擴展應用高清晰成像激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦平面的光

12、線被抑制，減少了成像的干擾，以及使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達普通光學顯微鏡的1.4倍?？梢郧逦谋憩F(xiàn)某些細微結(jié)構(gòu)。半定量熒光強度分析 熒光信號通過光電倍增管轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)過電腦分析可對熒光信號進行相對定量測定。 細胞中特異性熒光標記的蛋白在不同藥物環(huán)境和不同培養(yǎng)時間條件下的表達差異。 熒光探針的特異性標記：即熒光強度與特異性標記蛋白的表達量成正相關(guān)。 隨機選擇細胞或區(qū)域，測定其熒光強度值，并進行統(tǒng)計分析。半定量熒光強度分析隨機圈取細胞可得到所圈細胞的相對熒光強度值熒光表達量測定利用熒光與透射光同時掃描，觀測相等面積內(nèi)不同組間熒光標記蛋白表達的差異。熒光表達量測定分層掃描（切片掃描）

13、按共扼聚焦的原理，通過調(diào)節(jié)針孔的大小，可控制樣品掃描層面的厚度。即樣品中相當薄的一層被探測到，而其他層面不影響成像。分層掃描（切片掃描）當觀測較厚樣品時，普通透射光不能透過樣品，則可以通過切片掃描檢測熒光的方法來觀測。入射光被檢測層面整個樣品白光（不能透過）發(fā)射光分層掃描（切片掃描） 較厚層面 較薄層面人血管內(nèi)皮細胞PI標記觀測損傷。標記細胞為損傷細胞。分層掃描（切片掃描） 較厚層面 （平滑肌損傷可見） 較薄層面兔動脈血管內(nèi)皮細胞PI標記觀測損傷。標記細胞為損傷細胞。293細胞GFP的表達細胞“CT”片細胞測量熒光強度分析空間定位三維重建植物切片三維重建動態(tài)觀測激光共聚焦顯微鏡的一大特點就是可以對活細胞進行連續(xù)掃描，實現(xiàn)實時動態(tài)觀測。這樣可記錄細胞在外界某種條件的刺激下瞬時發(fā)生的變化。常用的有檢測細胞內(nèi)游離Ca 離子變化、細胞內(nèi)PH值變化，等等。Ca離子動態(tài)檢測熒光染料：Fluo-3AM。此染料可特異性標記細胞內(nèi)游離Ca離子，