實時熒光定量PCR完全手冊

1、實時熒光定量PCR ( RT-qPCR )完全手冊所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起 始模板定量及定性的分析。RT-qPCR是由三個步驟組成RT-qRCR影響分析可靠性關(guān)鍵點(Key porint) 關(guān)鍵詞：熒光實時實時熒光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反轉(zhuǎn)錄定量PCRQRT-PCR方法簡介所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢 測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量曲反應(yīng)中，引入了一種熒光 化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。

2、 每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的 變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。RT-qPCR是由三個步驟組成：反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;檢測:實時檢測和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.RT-qRCR影響分析可靠性關(guān)鍵點(Key porint):分析結(jié)果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測方法設(shè)計反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的非標(biāo)準(zhǔn)化影響試驗的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結(jié)果中會得到混淆的錯誤結(jié)果，因此 通過對RT-qPCR的每一組分進(jìn)行質(zhì)量評價以達(dá)到最小化變異性，最大化可重復(fù)性，而且還 需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分

3、析的指南。對基因表達(dá)分析的標(biāo)準(zhǔn)化的需要是與人類臨床診斷分 析相適應(yīng)的。Samp柏 typeRantJoin prirarsHNAtypePCR oof)ditionstranscriptasecDNA primiftgFigure 1 | Steps irrwolwd in planning a ffPqPCRass剪.The name to us permutations illustrate the alternatives and potent姑i fm rariabnlity associated with tlri$ techiriquespocmcprimersDta a禎1輝存C

4、4H 惟苗 WffiOUtinnoitton： spud 為 kntogrity:富才 猝聊qXR W spocrnc primasFIT 湘pRn 燦i pncii+n an，w cor orsptfiiCfcpniiftq?CR a$&?y vims non ana opbmcawxisamptoviKiaDon end pgim 的珈 ai Bv?vVf.bbioo.cofl?Figure 2 | RT-Timental worWlow. The four inainlhenn&$ (assay valxhticn and sample kin and data codec tion F

5、T-PtR assay and data ayialyas) are high lighted in different cdciSiCDOG9 哽 target Otioioa , chsfinlstrySnpto sei, ton, sdcUqt, 閭?cè)A蛔 & stocagPirinwf (and g劇 加即 nhMcrodi&ction capiirQ Ekro 口略日* 心宣卿屋”中g(shù)w職用and 伸皿zaiimRMA QttfacHMpTlnwr Corewlratkinopcma-aKw csybfi 村 n i)DHUKmOt wnaara te 網(wǎng)響RN4 quamiflcai

6、ton： Nancdrcp ot 削bo*grnPrinwr pMtonnajios viidarianq啊dalion Bas卸 鄒k*ncy ft 5知計秘號COimlnM Afr|PCR Stop存在的問題由于各個學(xué)術(shù)團(tuán)體和科研機(jī)構(gòu)使用不同的操作流程，必然導(dǎo)致大家使用不同定量的來源物以及數(shù)據(jù)分析：新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細(xì)胞，組培細(xì)胞總RNA或者mRNARNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的不同的引發(fā)策略不同的酶以及酶的不同組合變異系數(shù)、靈敏度多類型的檢測化學(xué)方法，反應(yīng)的條件，熱循環(huán)儀的分析以及匯報方式。每一步驟缺乏標(biāo)準(zhǔn)化分析流程造成了在樣品的處理，內(nèi)參的使用，歸一化

7、的方法，質(zhì)量控 制等等因素嚴(yán)重影響RT-qPCR的可信度，重復(fù)性。RNA質(zhì)量評價現(xiàn)在 RNA 定量的程序很多。最近 EMBO qPCR course ( HYPERLINK http:/www-db.embl.de/jss/Embl http:/www-db.embl.de/jss/Embl GroupsOrg/conf 28)比較了用 Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nan odrop and the BioRad Experion來定量同樣的樣品。結(jié)果顯示沒有哪兩種方法得到同樣 的分析數(shù)據(jù)。所以用不同的方法進(jìn)行定量是不明智

8、的。因此，我們需要用統(tǒng)一套定量分析方 法來完成所有RNA樣品的評價。RNA質(zhì)量RNA質(zhì)量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染）以及完整性。傳統(tǒng)的RNA 質(zhì)量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。Agil ent Bioanalyser/BioRad Experion微流體毛細(xì)電泳系統(tǒng)也是一種較新的分析方法。Agilent 的2100也是一種十分好的分析RNA質(zhì)量的方法，它通過分析18S以及28S rRNA的分析 圖譜，通過圖譜來反應(yīng)RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數(shù)（RIN）來反應(yīng)。樣 品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA

9、，4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非100%準(zhǔn)確定反應(yīng)mRNA的完整性，因為他們只是反應(yīng)rRNA的量來 間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3： 5分析法。3GAP DM mRNAAAAAAA.1JD4 MM 1 陰 1,017 HEX DM5SE Cy 429我們使用oligo dT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設(shè)計三 個taqman探針來定量三種相同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。探針設(shè)計的位點分別位于35以及中部。 擴(kuò)增產(chǎn)物的之間的比值反應(yīng)RNA的完整性。如果35的比值在1,反應(yīng)較高度完整性，如果 高于5說明降解。QRT-PCR抑

10、制物的組成QRT-PCR抑制物嚴(yán)重減少了 PCR的靈敏度以及熱動力學(xué)反應(yīng)，高度的抑制還導(dǎo)致假陰性的 結(jié)果。抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，hep arin 以及 IgG.是否有抑制物的評價體系：通過對目的樣品進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增效率的檢測通過內(nèi)部擴(kuò)增對照來反應(yīng)樣品處理過程中樣本的情況用細(xì)菌基因組檢測臨床樣品的抑制通過標(biāo)準(zhǔn)人工合成的擴(kuò)增進(jìn)行RT-PCR來反應(yīng)目標(biāo)檢測物的抑制情況反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)RT和PCR單一酶系統(tǒng)RT和PCR分離的酶系統(tǒng)RNA逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇引物主要有三種：1.隨機(jī)引物：隨機(jī)引物，特別是6nt引物對所有的靶位點不產(chǎn)生十分穩(wěn)定一致的

11、結(jié)果，建議 使用15nt的隨機(jī)引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的樣品，特別有polyA .而且對于一些特殊的變異體以及 較長的3UTR的區(qū)域比較困難特異引物：最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR優(yōu)化PCR優(yōu)化主要有：引物的濃度建議使用SYBR Green I和EvaGreen進(jìn)行擴(kuò)增和溶解曲線的測試筆者建議的操作流程：I.靶的選擇和試驗設(shè)計1.針對目的基因序列選擇合適的擴(kuò)增片斷查看以下三個網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實的QRT-PCR的擴(kuò)增引物,探針以及反應(yīng)條件.RTPrimerDB ( HYPERLINK http:/medgen.ugent.be/rtp

12、rimerdb http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb),PrimerBank ( HYPERLINK /primerbank/index.html /primerbank/index.html)Real Time PCR Primer Sets ( HYPERLINK )如果沒有合適的或者已經(jīng)證實的可以提供參考,以下的設(shè)計方案僅供參考：最廣泛使用的商業(yè)化的軟件 Beacon Designer( HYPERLINK )DIY 的軟件 Primer Express如果Beacon Designer無法得到您說需要的結(jié)果或者獲得到設(shè)計方案的備選數(shù)目不夠 的話，可以選擇 S

13、igma-Genosys HYPERLINK )的服務(wù)方案，詳細(xì)周到一個免費(fèi)的基于網(wǎng)頁構(gòu)架的引物和探針設(shè)計程序: HYPERLINK /product /product s/probe_design.asp您可以挑選其中的4-6對引物進(jìn)行試驗,選擇引物的擴(kuò)增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直 接與NCBI的網(wǎng)站進(jìn)行比對,并且用NCBI的ePCR進(jìn)行虛擬的電子PCR引物設(shè)計簡介DNA引物長度:15-25個堿基GC含量:50%左右如果引物的與AT區(qū)域富集結(jié)合，可以考慮用LNA替換幾個堿基，較少引物的長度以及避免引 物次級結(jié)構(gòu)和3端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭， 分之

14、內(nèi)雜交，倒轉(zhuǎn)重復(fù)等等會引起引物的引發(fā)探針對結(jié)合效率達(dá)降低,因此我們選擇引物二 聚體的&3為負(fù)值，即:10 kcal/mol.沒有連續(xù)的G/C.引物探針的保存一般遵循以下原則：正向和反向引物保存在-20度，濃度為10mM或者10 x工作濃度.探針應(yīng)該避光保存，貯存 在-70度，最好以凍干粉狀態(tài)，工作濃度的液體保存一般兩周左右。輸入靶序列，用 BLASTn 在 HYPERLINK /blast /blast 進(jìn)行比對檢查比對序列的多態(tài)性以及可能的錯誤避免這些區(qū)域來進(jìn)行引物和探針設(shè)計在靶序列中避免直接待重復(fù)區(qū)，在重復(fù)區(qū)進(jìn)行雜交容易使得引物非獲得產(chǎn)物性結(jié)合，降低 DNA的擴(kuò)增效率以及減少分析的靈敏度。

15、考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過生物信息學(xué)分析內(nèi)含子以及 外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設(shè)計跨最長內(nèi)含子區(qū)， 這樣減少了擴(kuò)增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當(dāng)用基因組D NA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟(jì)的做法是讓下游引物跨越剪接接 頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況 下，可以使用跨越單一外顯子的設(shè)計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去 gDNA的污染。在 RT 步驟時，用( HYPERLINK /applications/mfold/rna/fo