基因敲除與高表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、基因高表達(dá)利用高表達(dá)質(zhì)粒載體pCaEXP通過基因同源重組方法構(gòu)建SODs基因高 表達(dá)的VX2瘤株肝癌模型。一、材料、試劑和儀器高表達(dá)質(zhì)粒載體pCaEXP，大腸桿菌，培養(yǎng)基（按配方配制酵母浸膏 蛋白月東葡萄糖培養(yǎng)基），限制性內(nèi)切酶；Pyrobest DNA olymerase、 DNA Marker DL2000、Goldview核酸染料，質(zhì)粒DNA小量抽提試劑 盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，瓊脂糖，小量酵母菌總R NA抽提試劑盒， Real Time RT-PCR 所用試劑；Real Time PCR儀，F(xiàn)R-200紫外與可見分析裝置，電泳槽，高 速冷凍離心機(jī)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱。二、方法步驟為了實(shí)現(xiàn)

2、SODs基因的高表達(dá)，將SODs基因完整開放閱讀框（ORF） 連接于高表達(dá)質(zhì)粒載體pCaEXP中MET3啟動(dòng)子的后面，以實(shí)現(xiàn)MET3 對(duì)SODs基因ORF的控制。1、首先用基因組抽提試劑盒抽提SODs基因組，在SODs基因組中用含 有Bam H I和Pst I酶切位點(diǎn)的引物P1和P2擴(kuò)增SODs基因ORF全長(zhǎng)。2、使用上述兩個(gè)酶分別酶切SODs基因的ORF和pCaEXP質(zhì)粒，酶切 產(chǎn)物純化后使用T4 DNA ligase進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) 大腸桿菌DH5a，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取 陽性克隆擴(kuò)增后采用質(zhì)粒抽提試劑盒小量抽提質(zhì)粒，然后對(duì)所抽提 的高表達(dá)質(zhì)粒載體p

3、CaEXP-SPE 1采用酶切方法進(jìn)行鑒定?；蚯贸蚯贸酶伟┠Ｐ椭苽?，方法有很多種，如傳統(tǒng)ES打靶、 TALEN、CRISPR/Cas9，還有 TetraOneTM 基因敲除。以 CRISPR/Cas9 技術(shù)為例：一、材料、試劑和儀器sgRNA; UCA試劑盒（對(duì)sgRNA/Cas9進(jìn)行活性檢測(cè)），質(zhì)粒載體， sgRNA/Cas9 mRNA，PCR試劑盒，其他常規(guī)試劑；全自動(dòng)生化分析儀，微量移液器，電熱恒溫水浴箱，超凈工作臺(tái)， 凝膠圖像掃描儀，微波爐，混勻器，離心機(jī)，生物顯微鏡。二、方法步驟EGE技術(shù)（基于Crispr cas9技術(shù)）設(shè)計(jì)構(gòu)建識(shí)別靶序列的sgRNA;設(shè)計(jì)構(gòu)建致靶基因切割的

4、EGE系統(tǒng)載體質(zhì)粒；利用UCA試劑盒對(duì)sgRNA/Cas9進(jìn)行活性檢測(cè)；設(shè)計(jì)構(gòu)建打靶載體；體外轉(zhuǎn)錄 sgRNA/Cas9 mRNA;兔肝癌原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶載體；獲得Fo代兔，利用PCR對(duì)Fo代兔進(jìn)行基因型鑒定；獲得F1代兔，利用PCR和southern blot雜交技術(shù)對(duì)F1代兔進(jìn) 行基因型鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)一、材料、試劑和儀器 主要儀器與試劑勻膠機(jī)，光刻機(jī)，體視顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，等離子鍵合機(jī)， 酶標(biāo)儀，圖像處理軟件，CO培養(yǎng)箱，水浴鍋，灌流泵，大容量離心 機(jī)，超凈工作臺(tái)，移液器等；海藻酸鈉，氯化鈣，檸檬酸鈉，熒光素鈉，胰蛋白酶，小牛血清， RPMI-1640培養(yǎng)

5、基，胰蛋白酶，L-谷氨酰胺SU-8光刻膠及顯影液， Sylgard184型聚二甲基硅氧烷，染色劑，以及青霉素與鏈霉素。二、方法步驟HBSS 溶液：取 HBSS 47. 5 m L,分別加入 0. 5 mol / L EGTA0. 05 m L和1 mol / L HEPES2. 5 m L,充分均勻,4C保存?zhèn)溆谩FM培養(yǎng)液：取RPMI-1640培養(yǎng)基45 m L,分別加入50以g / m L 青鏈霉素0. 5 m L,10 mg /m L鏈霉素0. 25 m L,滅活小牛血清5 m L,200 mmol/L L-谷氨酰胺0. 5 m L,充分混勻備用。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中37C,5% CO2培養(yǎng)箱