TCID50概念方法電子教案

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。TCID50概念方法-山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動物微生物及免疫教案授課內(nèi)容血清學(xué)實(shí)驗(yàn)（二）教學(xué)方式PowerPoint講授授課班級授課時(shí)數(shù)2教學(xué)目標(biāo)說出沉淀試驗(yàn)的概念、類型和應(yīng)用，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和結(jié)果。教學(xué)過程復(fù)習(xí)提問并導(dǎo)入新課（約3min）回顧血清學(xué)試驗(yàn)的類型教學(xué)內(nèi)容（約82min）11-3沉淀試驗(yàn)一、原理：可溶性抗原抗體Ag-Ab沉淀現(xiàn)象二、類型1環(huán)狀沉淀試驗(yàn)：炭疽病的診斷、細(xì)菌的定型、血跡鑒定等2絮狀沉淀試驗(yàn)3瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：抗原與抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中擴(kuò)散，當(dāng)兩者比例適當(dāng)處相遇，發(fā)生沉淀

2、反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀帶。（1）單向單擴(kuò)散（2）單相雙擴(kuò)散（3）雙向單擴(kuò)散（4）雙相雙擴(kuò)散教學(xué)方法：比方、舉例11-4補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)簡介補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的原理、結(jié)果和應(yīng)用。11-5中和試驗(yàn)簡介中和試驗(yàn)的原理、結(jié)果和應(yīng)用。11-6免疫標(biāo)記技術(shù)簡介免疫標(biāo)記技術(shù)的原理特別介紹ELISA和熒光抗體技術(shù)小結(jié)（5min）復(fù)習(xí)思考題1什么是沉淀試驗(yàn)？2瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的原理和應(yīng)用？標(biāo)記的內(nèi)容為重點(diǎn)，標(biāo)記的內(nèi)容為難點(diǎn)。第三節(jié)沉淀試驗(yàn)一、沉淀試驗(yàn)的概念沉淀試驗(yàn)：可溶性抗原(如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等)與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的白色沉淀

3、，稱為沉淀試驗(yàn)（Precipitationreactiontest）。參與沉淀試驗(yàn)的抗原稱沉淀原，抗體稱沉淀素。二、沉淀試驗(yàn)的類型（一）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（ringprecipitationtest）用于抗原的定性試驗(yàn)，如診斷炭疽的Ascoli試驗(yàn)、鏈球菌的血清型鑒定、血跡鑒定。（二）瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)簡稱瓊擴(kuò)，1.概念：1%瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，因?yàn)槟z網(wǎng)孔中充滿水分，小于孔徑的抗原或抗體分子可在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，由近及遠(yuǎn)形成濃度梯度，當(dāng)二者在比例適當(dāng)處相遇時(shí)，即可發(fā)生沉淀反應(yīng)，因形成的抗原抗體復(fù)合物為大于凝膠孔徑的顆粒，不能在凝膠中再擴(kuò)散，就在凝膠中形成肉眼可見的沉淀帶，稱此試驗(yàn)為瓊脂凝膠

4、擴(kuò)散試驗(yàn)。2.瓊脂擴(kuò)散分四類(圖11-3)：單向單擴(kuò)散單向雙擴(kuò)散雙向單擴(kuò)散雙向雙擴(kuò)散。（1）雙向單擴(kuò)散又稱輻射擴(kuò)散應(yīng)用：傳染病的診斷，如雞馬立克氏病的診斷。（2）雙向雙擴(kuò)散應(yīng)用最廣泛應(yīng)用：細(xì)菌、病毒的鑒定和傳染病的診斷。如檢測口蹄疫、馬立克氏病、禽流感、傳染性法氏囊病的瓊脂擴(kuò)散方法。雙擴(kuò)散用于檢測抗體(圖11-4)瓊脂擴(kuò)散四種基本類型（據(jù)陸承平）雙擴(kuò)散用于檢測抗體（據(jù)陸承平）（三）免疫電泳免疫電泳技術(shù)是把凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)與電泳技術(shù)相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：在瓊脂擴(kuò)散的基礎(chǔ)上，提高了反應(yīng)速度、反應(yīng)靈敏度和分辨率。在臨床上應(yīng)用比較廣泛的有對流免疫電泳和火箭免疫電泳等。1.對流免疫電泳(圖11-5)是

5、將雙向雙擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。用于多種傳染病的快速診斷。如口蹄疫、豬傳染性水皰病等病毒病的診斷。2.火箭免疫電泳(圖11-6)是將輻射擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)檢測技術(shù)，簡稱火箭電泳。將pH8.28.6的巴比妥緩沖液瓊脂融化后，冷至56左右，加入一定量的已知抗血清，澆成含有抗體的瓊脂凝膠板。在板的負(fù)極端打一列孔，孔徑3mm，孔距8mm，滴加待檢抗原和已知抗原，電泳210h。電泳時(shí)，抗原在含抗血清的凝膠板中向正極遷移，其前鋒與抗體接觸，形成火箭狀沉淀弧，隨抗原繼續(xù)向前移動，此火箭狀鋒亦不斷向前推移，原來的沉淀弧由于抗原過量而重新溶解。最后抗原抗體達(dá)到平衡時(shí)，即形成穩(wěn)定的火箭狀沉淀弧

6、（圖11-6）。在試驗(yàn)中由于抗體濃度保持不變，因而火箭沉淀弧的高度與抗原濃度呈正比，本法多用于檢測抗原的量（用已知濃度抗原作對比）。第四節(jié)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一、基本原理（圖11-7）本試驗(yàn)包括兩個(gè)系統(tǒng)共五種成分：檢測系統(tǒng)（溶菌系統(tǒng)）：即已知的抗原（或抗體）、被檢的抗體(或抗原)和補(bǔ)體；指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：包括綿羊紅細(xì)胞、溶血素和補(bǔ)體。二、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的基本過程及應(yīng)用基本過程：第一步為反應(yīng)系統(tǒng)作用階段第二步是溶血系統(tǒng)作用階段觀察結(jié)果：最終表現(xiàn)是不溶血，說明待檢的抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合，結(jié)果是陽性；最終表現(xiàn)是溶血，說明待檢的抗體不存在或與抗原不相對應(yīng)，結(jié)果是陰性。應(yīng)用：1.診斷傳染病，如結(jié)核、副結(jié)核、鼻

7、疽、牛肺疫、馬傳染性貧血、乙型腦炎、布氏桿菌病、鉤端螺旋體病、錐蟲病等。2.鑒定病原體，如對流行性乙型腦炎病毒的鑒定和口蹄疫病毒的定型等。第五節(jié)中和試驗(yàn)根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗(yàn)，稱中和試驗(yàn)(Neutralizationtest）。中和試驗(yàn)極為特異和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清學(xué)診斷、病毒分離株的鑒定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的評價(jià)、血清抗體效價(jià)的檢測等。中和試驗(yàn)可在體內(nèi)進(jìn)行也可在體外進(jìn)行。體內(nèi)中和試驗(yàn)也稱保護(hù)試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)先對實(shí)驗(yàn)動物接種疫苗或抗血清，間隔一定時(shí)間后，再用一定量病毒攻擊，最后根據(jù)動物是否得到保護(hù)來判定結(jié)果。常用于疫苗免疫原性的評價(jià)和抗

8、血清的質(zhì)量評價(jià)。體外中和試驗(yàn)是將抗血清與病毒混合，在適當(dāng)條件下作用一定時(shí)間后，接種于敏感細(xì)胞、雞胚或動物，以檢測混合液中病毒的感染力。根據(jù)保護(hù)效果的差異，判斷該病毒是否已被中和，并可計(jì)算中和指數(shù)，即中和抗體的效價(jià)。根據(jù)測定方法不同，中和試驗(yàn)有終點(diǎn)法中和試驗(yàn)和空斑減數(shù)法中和試驗(yàn)等方法。毒素和抗毒素也可進(jìn)行中和試驗(yàn)。其方法與病毒的中和試驗(yàn)基本相同。一、終點(diǎn)法中和試驗(yàn)HYPERLINK:8022/wswjpkcllja/16.doclannotation1#annotation1l終點(diǎn)法中和試驗(yàn)（Endpointneutralizationtest）是滴定使病毒感染力減少至50%時(shí)，血清的中和效價(jià)或

9、中和指數(shù)。有固定病毒稀釋血清和固定血清稀釋病毒兩種方法。(一)固定病毒稀釋血清法將已知的病毒量固定，血清作倍比稀釋，常用于測定抗血清的中和效價(jià)。1.病毒毒價(jià)單位病毒毒價(jià)(毒力)的單位過去多用最小致死量(MLD)，但由于劑量的遞增與死亡率遞增的關(guān)系不是一條直線，而是呈S形曲線，在越接近100死亡時(shí)，對劑量的遞增越不敏感。而死亡率愈接近50%時(shí)，劑量與死亡率呈直線關(guān)系，所以現(xiàn)基本上采用半數(shù)致死量(LD50)作為毒價(jià)單位，而且LD50的計(jì)算應(yīng)用了統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，減少了個(gè)體差異的影響，因此比較準(zhǔn)確。以感染發(fā)病作為指標(biāo)的，可用半數(shù)感染量(ID50)。用雞胚測定時(shí)，可用雞胚半數(shù)致死量(ELD50)或雞胚半數(shù)感

10、染量(EID50)；用細(xì)胞培養(yǎng)測定時(shí)，可用組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)。在測定疫苗的免疫性能時(shí)，則用半數(shù)免疫量(IMD50)或半數(shù)保護(hù)量(PD50)。2.病毒毒價(jià)測定將病毒原液作10倍遞進(jìn)稀釋即10-1、10-2、10-3，選擇46個(gè)稀釋倍數(shù)接種一定體重的試驗(yàn)動物(或雞胚、細(xì)胞)，每組36只(個(gè)、孔)。接種后，觀察一定時(shí)間內(nèi)的死亡(或出現(xiàn)細(xì)胞病變)數(shù)和生存數(shù)。根據(jù)累計(jì)死亡數(shù)和生存數(shù)計(jì)算致死百分率。然后按Reed-Muench法、內(nèi)插法或Karber法計(jì)算半數(shù)劑量。以TCID50測定為例說明如下：按Karber法計(jì)算，其公式為lgTCID50=L+d(S-0.5)，L為病毒最低稀釋度的對數(shù)

11、；d為組距，即稀釋系數(shù)，10倍遞進(jìn)稀釋時(shí)d為-1；S為死亡比值之和（計(jì)算固定病毒稀釋血清法中和試驗(yàn)效價(jià)時(shí)，S應(yīng)為保護(hù)比值之和），即各組死亡（感染）數(shù)/試驗(yàn)數(shù)相加。若以測定某種病毒的TCID50為例，病毒作10-410-7稀釋，記錄其出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）的情況（表11-1）。則L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16lgTCID50=(-4)+(-1)(2.16-0.5)=-5.66。TCID50=10-5.66，0.1ml。TCID50為毒價(jià)的單位，表示該病毒經(jīng)稀釋至10-5.66（1/105.66）時(shí)，每孔細(xì)胞接種0.1ml，可使50%的細(xì)胞孔出現(xiàn)CPE。而病毒的毒

12、價(jià)通常以每ml或每mg含多少TCID50或（LD50等）表示。如上述病毒的毒價(jià)為105.66TCID50/0.1ml，即106.66TCID50/ml。表11-1病毒毒價(jià)滴定(接種劑量0.1ml)病毒稀釋CPE陽性數(shù)陰性數(shù)%10-410-510-610-765200146100833303.正式試驗(yàn)將病毒原液稀釋成每一單位劑量含200LD50(或EID50、TCID50)，與等量遞進(jìn)稀釋的待檢血清混合，置37感作1h。每一稀釋度接種36只（個(gè)、管）試驗(yàn)動物(或雞胚、細(xì)胞)，記錄每組動物的存活數(shù)和死亡數(shù)，同樣按Reed-Muench法或Karber法計(jì)算其半數(shù)保護(hù)量（PD50），即該血清的中和價(jià)

13、。(二)固定血清稀釋病毒法將病毒原液作10倍遞進(jìn)稀釋，分裝兩列無菌試管，第一列加等量正常血清(對照組)，第二列加等量待檢血清(中和組)；混合后置37感作1h，每一稀釋度接種36只試驗(yàn)動物(或雞胚、組織細(xì)胞)，記錄每組動物死亡數(shù)、累積死亡數(shù)和累積存活數(shù)（表11-2），按Karber法計(jì)算LD50，然后計(jì)算中和指數(shù)。中和指數(shù)=中和組LD50/對照組LD50。按表11-3的結(jié)果：中和指數(shù)=10-2.2/10-5.5=103.3，查3.3的反對數(shù)為1995，即103.3=1995，也就是說該待檢血清中和病毒的能力比正常血清大1994倍。通常待檢血清的中和指數(shù)大于50者即可判為陽性，1040為可疑，小于

14、10為陰性。表11-2固定血清稀釋病毒法中和指數(shù)測定舉例病毒稀釋10-110-210-310-410-510-610-7LD50中和指數(shù)正常血清組待檢血清組4/43/41/40/44/42/41/40/40/40/40/410-5.510-2.2103.3=1995二、空斑減數(shù)試驗(yàn)（Plaguereductiontest）空斑或蝕斑是指把病毒接種于單層細(xì)胞，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，進(jìn)行染色，原先感染病毒的細(xì)胞及病毒擴(kuò)散的周圍細(xì)胞會形成一個(gè)近似圓形的斑點(diǎn)，類似固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)?？瞻邷p數(shù)試驗(yàn)是應(yīng)用空斑技術(shù)，使空斑數(shù)減少50%的血清稀釋度為該血清的中和效價(jià)。試驗(yàn)時(shí)，將已知空斑形成單位（PFU）的病毒

15、稀釋成每一接種劑量含100PFU，加等量遞進(jìn)稀釋的血清，37感作1h。每一稀釋度至少接種3個(gè)已形成單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，每瓶0.20.5ml，37感作1h，使病毒與血清充分作用，然后加入在44水浴預(yù)溫的營養(yǎng)瓊脂（在0.5%水解乳蛋白或Eagles液中，加2%犢牛血清、1.5%瓊脂及0.1%中性紅3.3ml）10ml，平放凝固后，將細(xì)胞面朝上放入無燈光照射的37CO2培養(yǎng)箱中。同時(shí)用稀釋的病毒加等量Hanks液同樣處理作為病毒對照。數(shù)天后分別計(jì)算空斑數(shù)，用Reed-muench法或Karber法計(jì)算血清的中和滴度。第六節(jié)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和標(biāo)記分子極易檢測的高度敏感性

16、相結(jié)合形成的試驗(yàn)技術(shù)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有熒光抗體標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)抗體技術(shù)同位素標(biāo)記抗體技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性大大超過常規(guī)血清學(xué)方法一、熒光抗體標(biāo)記技術(shù)（fluorescent-labelledantibodytechnicque）用熒光色素標(biāo)記（一）原理將抗原抗體反應(yīng)的特異性、熒光檢測的高敏性、以及顯微鏡技術(shù)的精確性三者結(jié)合（二）熒光色素可用于標(biāo)記的熒光色素有：異硫氰酸熒光黃(FITC)：應(yīng)用最廣，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，熒光抗體四乙基羅丹明(RB200)四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC）（三）熒光抗體染色及熒光顯微鏡檢查1標(biāo)本片的制備標(biāo)本要相當(dāng)薄，并要有適宜的固定處理方法。細(xì)菌培養(yǎng)物、血液、膿

17、汁、糞便、尿沉渣及感染的動物組織等，制成涂片或壓印片。感染組織最好制成冰凍切片或低溫石蠟切片。也可用生長在蓋玻片上的單層細(xì)胞培養(yǎng)作標(biāo)本。標(biāo)本固定的目的：一是防止被檢材料從玻片上脫落；二是消除抑制抗原抗體反應(yīng)的因素最常用的固定劑是丙酮和95%的乙醇固定后用PBS反復(fù)沖洗，干后即可用于染色。2染色方法熒光抗體染色法有多種類型，常用的有直接法和間接法兩種。（1）直接法（圖11-8）熒光色素標(biāo)記的抗體染色優(yōu)點(diǎn)：簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)：敏感性偏低，而且每檢一種抗原就需要制備一種熒光抗體。（2）間接法（圖11-9）熒光色素標(biāo)記的第2抗體(抗抗體)染色間接法的優(yōu)點(diǎn)是，比直接法敏感，對一種動

18、物只需制備一種熒光抗抗體，即可用于多種抗原或抗體的檢測，鏡檢所見熒光也比直接法明亮。（3）抗補(bǔ)體法熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體染色液特異性和敏感性均高，但易產(chǎn)生非特異性熒光。3熒光顯微鏡檢查熒光顯微鏡，倒置熒光顯微鏡觀察。（四）熒光抗體標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用1細(xì)菌病診斷2病毒病診斷二、酶標(biāo)抗體技術(shù)（enzyme-labelledantibodytechnicque）（一）原理酶標(biāo)抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性酶催化反應(yīng)的高度敏感性:酶是一種催化劑，不被消耗，能反復(fù)作用，微量高效性，如果產(chǎn)物為有色可見產(chǎn)物，則極為敏感。既特異又敏感，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種免疫檢測方法之一。（二）用于標(biāo)記的酶用于標(biāo)記的酶:辣

19、根過氧化物酶(HRP)堿性磷酸酶HRP作用底物是過氧化氫，常用供氫體有：鄰苯二胺(0PD)：D氧化后形成可溶性產(chǎn)物，橙色，不穩(wěn)定，須現(xiàn)用現(xiàn)配3,3,-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)：反應(yīng)后形成不溶性的棕色物質(zhì)，可用光學(xué)顯微鏡和肉眼觀察（供氫體為顯色劑，因能在HRP催化H2O2生成H2O過程中提供氫，自己生成有色產(chǎn)物）HRP可制成酶標(biāo)抗體。（三）免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)又稱免疫酶染色法。是將酶標(biāo)記的抗體應(yīng)用于組織化學(xué)染色，以檢測組織和細(xì)胞中或固相載體上抗原或抗體的存在及其分布位置的技術(shù)。1標(biāo)本制備和處理2染色方法。（1）直接法酶標(biāo)抗體（2）間接法酶標(biāo)記的抗抗體。3顯色反應(yīng)4標(biāo)本觀察優(yōu)于免疫熒光抗體技術(shù)之處，在于毋須應(yīng)用熒光顯微鏡，且標(biāo)本可以長期保存。（四）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)1固相載體有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。2包被將抗原或抗體吸附于固相表面的過程，稱載體的致敏或包被3洗滌通常采用含助溶劑吐溫-20(最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%)的PBS作洗滌液。4試驗(yàn)方法（圖11-10）（1）間接法用于測定抗體酶標(biāo)記的抗抗體樣品中含抗體越多出現(xiàn)顏色越快越深（2）夾心法又稱雙抗體法用于測定大分