β-arrestin2通過調(diào)控自噬水平在結(jié)腸炎中的作用

1、0 -arrestin2通過調(diào)控自噬水平在結(jié)腸炎中的作用郭佳翔翟曉明劉慧玲徐敏儀吳淑云陶金【摘要】目的研究抑制蛋白2 (3-arrestin2)是否通遇調(diào)控自 噬水平在結(jié)腸炎中發(fā)揮作用。方法B-arrestin2野生型(WT)小鼠 和B-arrestin2基因敲除(K0)小鼠各20只，隨機(jī)分為4組，每組 各10只，分別為B-arrestin2WT對照組和實驗組，0 -arrestin2KO 對照組和實驗組。實驗組小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉7d誘導(dǎo)急性 潰瘍性結(jié)腸炎，對照組給予無菌ddH20。觀察并記錄各組小鼠的疾病 活動指數(shù)。收集小鼠結(jié)腸組織，免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡法檢測 自噬相關(guān)蛋白微

2、管相關(guān)蛋白1輕鏈3 8 (LC3B)、Beclinl的表達(dá)水平。 在HCoEpiC細(xì)胞中，通過siRNA沉默B-arrestin2的表達(dá)，Earle s 平衡鹽溶液(EBSS)處理細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，檢測LC3B表 達(dá)水平。結(jié)果B-arrestin2WT實驗組小鼠的結(jié)腸黏膜自噬相關(guān)蛋白 表達(dá)水平上調(diào)，而arrestin2Ko實驗組小鼠的結(jié)腸炎癥程度明顯 改善，自噬相關(guān)蛋白LC3BTI/I表達(dá)水平下降(P0.05),但Beclinl 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0. 05)o在HCoEpiC細(xì)胞中沉默 B-arrestin2的表達(dá)，EBSS處理后，LC3B-II/ I表達(dá)水平下調(diào)。結(jié)

3、論在結(jié)腸炎中，B-arrestin2調(diào)控自噬水平，當(dāng)B-arrestin2缺失 時，可以通過抑制自噬改善結(jié)腸炎?！娟P(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎；自噬；抑制蛋白2；小鼠;HCoEpiC細(xì)胞【AbstractObjectiveToexplorewhether B -arrestin2playsarolebyregulating autophagyincolitis. Methods20 P -arrestin2wiId-type ( WT ) 細(xì)胞的病原體。同時在腸道中，內(nèi)源性和外源性微生物可通過自噬進(jìn) 行抗原呈遞，并對共生物抗原耐受性的產(chǎn)生具有重要作用18。許多 自噬相關(guān)蛋白(如Beclinl Atg3

4、、Atg5和Atg7)對T淋巴細(xì)胞的 生存、發(fā)育和成熟是必要的19-20。干擾自噬導(dǎo)致腸道內(nèi)固有免疫 和適應(yīng)性免疫受損，自噬缺陷可影響細(xì)胞抗原肽的呈遞、損害細(xì)胞內(nèi) 細(xì)菌清除能力等然而，自噬是把雙刃劍，在炎癥中具有雙 向調(diào)節(jié)作用，適當(dāng)?shù)淖允煽梢越到馐軗p或衰老的細(xì)胞器以及錯誤折疊 的蛋白質(zhì)，而過度的自噬會引起細(xì)胞自噬性死亡。有研究報道，過度 的自噬會損害上皮細(xì)胞的緊密連接，抑制過度的自噬，從而恢復(fù)ZOT 和E-cadherin的表達(dá)21。為此，我們在實驗中先探究了小鼠急性 UC模型中自噬水平的變化，通過蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)等檢 測方法，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)小鼠急性UC后，自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)。 而

5、B，rrestin2的缺失可以改善小鼠余吉腸黏膜的炎癥，于是我們進(jìn) 一步探究-arrestin2是否可以通過調(diào)控自噬來調(diào)節(jié)腸道的炎癥。因此我們分析了 B-arrestin2WT小鼠和B-arrestin2Ko小鼠在急性 UC模型中自噬水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B-arrestin2的缺失可以抑制 自噬的發(fā)生，進(jìn)一步在人源性的結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpic中進(jìn)行驗證。 通過饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)沉默B-arrestin2表達(dá)的細(xì)胞 中，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降，自噬水平受到抑制。綜上所述，-arrestin2的缺失抑制自噬的發(fā)生，緩解腸道的炎癥 反應(yīng)，為UC的治療提供新的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)lKoba

6、yashiT , SiegmundB , LeBerreC , etal.Ulcerativecolitis. NatRevDisPrimers, 2022, 6 (1)： 74.2MizushimaN,KomatsuM. Autophagy： renovationofcellsandtissues.Cell, 2022, 147 (4)： 728-741. TOC o 1-5 h z 3LarabiA,BarnichN,NguyenHTT. Newinsightsintotheinterplaybetweenautophagy , gutmicrobiotaandinflammatoryre

7、sponsesinlBD. Autophagy, 2022, 16 (1)： 38-51.4ChaturvediM,MaharanaJ,ShuklaAK. TerminatingG-proteincoupling：structuralsnapshotsofGPCR-B -arrestincomplexes. Cell, 2022, 180 (6)： 1041-1043.5MaTL ,ZhouY ,ZhangCY ,etaL Theroleandmechanismof B -arrestin2insignaltransduction. LifeSci, 2022, 275： 119364.6Ze

8、ngLX ,TaoJ ,LiuHL ,etaL B -arrestin2encouragesinflammation-inducedepithelialap optosisthroughERstress/PUMAincolitis. MucosalImmunol, 2022, 8 (3)： 683-695.7deSouzaHS , FiocchiC. ImmunopathogenesisofIBD ： currentstateoftheart. NatRevGastroenterolHepatol,2022, 13(1)： 13-27.8AnanthakrishnanAN. Epidemiol

9、ogyandriskfactorsforIBD. NatRe vGastroenterolHepatol, 2022, 12 (4)： 205-217.9LuanB ,ZhangZ ,WuY ,etaL Betaarrestin2functionsasaphosphorylation-regulatedsupp ressorofUV-inducedNF-kappaBactivation. EMB0J, 2022, 24 (24)： 4237-4246. TOC o 1-5 h z 10FreedmanNJ,ShenoySK. Regulationofinflammationby 8 -arre

10、stins：notjustreceptortales. CellSignal, 2022, 41： 41-45. llYuMC ,SuLL ,ZouL ,etal. Anessentialfunctionforbeta-arrestin2intheinhibitorysig nalingofnaturalkillercells. Natlmmunol, 2022, 9 (8)： 898-907. 12BrycesonYT,LjunggrenHG. ArrestinNKcelIcytotoxicity. Natlmmunol , 2022 , 9 (8)： 835-836.13SharmaD ,

11、 MalikA , SteuryMD , etaL Protectiveroleof B -arrestin2incolitisthroughmodulation ofT-cellactivation. InflammBowelDis, 2022, 21 (12)： 2766-2777. 14JacobC , YangPC , DarmoulD , etal. Mastcelltryptasecontrolsparacellularpermeabilityofthei ntestine. Roleofprotease-activatedreceptor2andbeta-arrestins .J

12、BiolChem, 2022, 280 (36)： 31936-31948.15KimS,EunHS,JoEK. Rolesofautophagy-relatedgenesinthepathogenesisofinflam matoryboweldisease. Cells, 2022, 8 (1)： 77. 16CadwellK , LiuJY , BrownSL , etal. AkeyroleforautophagyandtheautophagygeneAtgl611inmousea ndhumanintestinalpanetheeIls. Nature, 2022,456(7219)

13、：259-263. 17HooperKM , BarlowPG , HendersonP , etal.Interactionsbetweenautophagyandtheunfoldedproteinrespo nse： imp1icationsforinflammatoryboweldisease. InflammBowe1Dis, 2022, 25 (4)： 661-671.18BaxtLA,XavierRJ. Roleofautophagyinthemaintenanceofintestinalhomeost asis. Gastroenterology, 2022, 149 (3)：

14、 553-562. 19KovacsJR,LiC ,YangQ ,etal. AutophagypromotesTcellsurvivalthroughdegradationofprot einsofthece11deathmachinery. CellDeathDiffer, 2022, 19 (1)： 144-152. 20KabatAM , HarrisonOJ , RiffelmacherT ,etal. TheautophagygeneAtgl611differentiallyregulatesTregandT H2cel1stocontrolintestinal inflammat

15、ion. Elife. 2022,5： el2444. 21LiM,LuoT ,HuangY ,etal. Polysaccharidefrompycnoporussanguineusamelioratesdextr ansulfatesodium-inducedcolitisviahelperTcellsrepertoiremodu lationandautophagysuppression. PhytotherRes, 2022, 34 (10)： 2649-2664.(收稿日期：2022-10-25)(本文編輯：楊江瑜) TOC o 1-5 h z and20 -arrestin2kno

16、ckout(KO)micewererandomlyandevenlydividedintofourgroups,including B -arrestin2WTcontrolgroupandexperimentalgroup , B -arrestin2K0controlgroupandexperimentalgroup. Intheexperim entalgroups,themiceweregivenfreeaccessto3%dextransulfatesodium ( DSS ) for7dtoinduceacutecolitis. Inthecontrolgroups,themice

17、weregivensterileddH20. Thediseaseactivityindexofmicew asobservedandrecordedineachgroup. Thecolontissuesofmicewerec ollected,andtheexpressionlevelsofautophagy-relatedproteinsincludingL C3BandBeclinlwereobservedanddetectedbyimmunohistochemistrya ndwesternblot. Theexpressionof B -arrestin2wasknockdownb

18、ysiRN AinHCoEpiCcells,andthenthecellsweretreatedbyEarle sBalancedSaltSolution( EBSS )toinduceautophagy. Then ,theexpressionlevelofLC3Bproteinwasdetected. ResultsTheexpres sionofautophagy-relatedproteinswassignificantlyup-regulated inthecolonmucosaltissuesofWTexperimentalmice. ComparedwithWT mice,the

19、colonicinflammationwassignificantlyamelioratedin B -arres tin2K0miceafterDSStreatment. Andtheexpressionlevelsofautopha gy-relatedproteinsLC3B- II/ I weresignificantlydown-regulated in B -arrestin2K0miceintheexperimentalgroups(PO. 05) .ThereisnosignificantdifferenceintheexpressionleveIsofBeclinl(PO.

20、05 ) .Afterknockingdowntheexpressionof 8 -arrestin2inHCoEpiCcellsandEBSStreatment,theexpressionlevelsofLC3B- II/ I weresignificantlydown-regula ted(PO. 05) .Conclusion B -arrestin2canregulatetheautophagyinco litis, andthedeficiencyof B -arrestin2caninhibitautophagytoameliora tethecoIonicinflammation

21、.KeywordsUIcerativeco1itis；Autophagy； B -arrestin2；Mouse；HCoEpiCcell 潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病(IBD),主要累 及結(jié)直腸黏膜層及黏膜下層。血性腹瀉、腹痛是UC最常見的臨床癥 狀。目前病因尚不明確，研究表明其與環(huán)境、遺傳易感性、腸道菌群 失調(diào)和免疫反應(yīng)紊亂等因素相關(guān)1。自噬是真核細(xì)胞的一個基本生 物過程，自噬通過對蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的分解代謝，在能量穩(wěn)態(tài)中起重 要作用，主要分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬等2。巨 自噬是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體來源的隔膜在待降解物質(zhì)周圍形成自噬 小體，運(yùn)輸至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解

22、的過程。全基因組關(guān)聯(lián)研究確定IBD 的多個易感基因，大量的研究表明自噬在維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重 要作用，可能與IBD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)3。B -抑制蛋白2 (B -arrestin2)是Arrestins家族中的一員，是廣泛存在于細(xì)胞膜 和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的支架蛋白4。B -arrestin2不僅介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR)的脫敏、內(nèi)化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；同時還通過參與胰島素生長因子1 (IGF-1)、核因子-kB (NFkB)、p53、Wnt、PI3K/Akt 等多條信 號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化、凋亡、自噬等功能，在許多生理和病 理過程中起著重要作用5。筆者團(tuán)隊既往的研究發(fā)現(xiàn)B-arrestin2 可以

23、促進(jìn)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎黏膜的細(xì)胞凋亡，然而 在結(jié)腸炎中，3 -arrestin2是否對自噬存在調(diào)控作用尚不清楚6。 本研究通過建立B-arrestin2野生型（WT）和B-arrestin2基因敲 除型（K0）小鼠急性UC模型以及干擾B-arrestin2在HCoEpiC細(xì)胞 中的表達(dá)，探討B(tài)-arrestin2在小鼠UC中對自噬水平的調(diào)控。材料與方法一、材料.實驗動物SPF級別的C57BL/6J小鼠20只,雌雄各半,8周齡,體質(zhì)量2025g, 購自廣東藥康生物科技有限公司。B-arrestin2Ko小鼠于中山大學(xué) 附屬第三醫(yī)院疫苗研究所動物中心進(jìn)行繁育、飼養(yǎng)并用于實驗。本動

24、物實驗倫理經(jīng)中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會審批通過 （F2-09-0901）o.實驗細(xì)胞系人源的正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系HCoEpiC細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 消化內(nèi)科實驗室凍存保槿。.主要試劑與抗體DSS （MPBiomedicals,美國）、高糖 DMEM 培養(yǎng)基（Gibco,美國）、胎 牛血清（Gibco,美國）、3 -arrestin2siRNA （吉瑪基因，中國）、 B -actin抗體（SantaCruz,美國）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 B （LC3B） 抗體（Abeam,美國）、Beclinl 抗體（CST,美國）、p-Akt （CST,美 國）、3 -arrestin2 抗體（Pr

25、oteintech,中國）、Earle? s 平衡鹽 溶液（EBSS, Gibco,美國）。.主要儀器）、SDS電泳槽）、SDS電泳槽二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific,（BI0-RAD,美國）、半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD,美國）、PCR 儀（BIO-RAD, 美國）。二、方法.小鼠急性UC模型的建立選取8周大的C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為B-arrestin2WT對照組、B -arrestin2WT 實驗組、B -arrestin2K0 對照組和 B -arrestin2K0 實驗組，每組10只。WT對照組和K0對照組小鼠給予無菌的ddH20 自由飲用，WT實驗組和K0實驗組

26、小鼠自由飲用含3%DSS的無菌ddH2O7d,誘導(dǎo)小鼠急性UC。.疾病活動指數(shù)評分從造模的第1日起，每日觀察小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀和糞便隱血情 況，計算小鼠疾病活動指數(shù)。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：體質(zhì)量正常為0 分，體質(zhì)量下降1%5%為1分，下降5%10%為2分，下降10%20% 為3分，下降大于20%為4分;大便成形為0分，呈糊狀或半成形為1 分，稀便為4分;糞便潛血陰性為0分，大便潛血陽性為2分，肉眼 血便為4分。.小鼠結(jié)腸標(biāo)本的收集造模結(jié)束后，對小鼠進(jìn)行腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后行頸椎 脫臼處死。剖開腹部暴露腹腔，取出全結(jié)腸，放置冰盒上?？v行剖開 小鼠結(jié)腸，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗結(jié)腸內(nèi)容物

27、。部分結(jié)腸組織進(jìn)行固 定后續(xù)包埋，部分結(jié)腸組織刮取腸黏膜后置于-8（rc冰箱中保存，后 續(xù)提取蛋白質(zhì)。. HE染色將制備好的蠟塊切片，進(jìn)行脫蠟和梯度水化處理后，滴加蘇木素染液 30s,流水沖洗后置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中反藍(lán)。隨后用伊紅染液 染色I(xiàn)min,流水沖洗后顯微鏡下觀察染色情況，封片，拍照。.免疫組織化學(xué)染色將制備好的蠟塊切片，進(jìn)行脫蠟和梯度水化處理后，在3%雙氧水中 孵育lOmin,然后進(jìn)行抗原修復(fù)，用5%的牛血清白蛋白封閉30mino 一抗稀釋液4C孵育過夜,PBS清洗，對應(yīng)的二抗稀釋液37。孵育2h。 PBS沖洗后DAB顯色，蒸水終止反應(yīng)。蘇木素染液染色后，封片, 拍照。.細(xì)胞

28、培養(yǎng)將HCoEpic細(xì)胞用完全培養(yǎng)基，置于5%0)2、37。!培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 觀察細(xì)胞的生長狀況。待細(xì)胞處于對數(shù)增長期時，胰酶消化，用培養(yǎng) 基重懸細(xì)胞，按1 ：4的比例傳代。. siRNA沉默B-arrestin2基因的表達(dá)當(dāng)細(xì)胞生長到50%的密度時，根據(jù)siRNA說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，沉默 3-arrestin2基因的表達(dá)。siRNA干擾效率通過實時熒光定量PCR (RT-PCR)和蛋白免疫印跡進(jìn)行檢測。將消化重懸的細(xì)胞鋪于12孔 板中，使24h后達(dá)到50%,用siRNA沉默3-arrestin2的表達(dá)。EBSS 處理細(xì)胞2ho.細(xì)胞RNA提取及RT-PCR檢測mRNA表達(dá)根據(jù)試劑盒說明書

29、提取細(xì)胞中的總RNA,測定提取的RNA樣品的純度 及濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測定目的基因的mRNA表達(dá)水平。目的基因引物序 列見表lo.結(jié)腸黏膜和細(xì)胞總蛋白提取及蛋白免疫印跡根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書對結(jié)腸黏膜細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取和定量。取蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2h。用磷酸鹽吐溫緩 沖液洗滌后，一抗孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌后，對應(yīng)的 二抗室溫孵育2h,化學(xué)發(fā)光法顯像，采用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行 灰度分析。三、統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS2L0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)均以表示，2 組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P0. 05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采 用GraphPadprism8

30、. 0軟件進(jìn)行作圖。結(jié)果一、小鼠急性UC的結(jié)腸黏膜自噬水平上調(diào)用DSS誘導(dǎo)3-arrest in2WT小鼠進(jìn)行急性UC造模后，與3 -arrest in2WT對照組相比,3 -arrest in2WT對照組相比,-arrestin2WT實驗組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.933, P0. 001),見圖1A和B。結(jié)腸切片HE染色結(jié)果顯示，B -arrestin2WT對照組結(jié)腸黏膜幺吉構(gòu)完 整，腺體排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤，而arrestin2WT實驗組 小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)被破壞，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，糜爛和潰瘍形成，炎癥細(xì) 胞浸潤，見圖1C。以上結(jié)果說明小鼠急性UC造模成功。根據(jù)免疫

31、組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與B-arrestin2WT對照組小鼠相 比，3 -arrestin2WT實驗組小鼠結(jié)腸黏膜Beclinl表達(dá)水平明顯增 加，見圖1D。蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，B-arrestin2WT實驗組 小鼠結(jié)腸黏膜組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B-II/【和Beclinl表達(dá)水平 均高于B-arrestin2WT對照組，2組蛋白相對表達(dá)量比較差異均有 統(tǒng)計學(xué)意義 統(tǒng)Be學(xué)in又2. 907, tLC3B-II/ I =3. 194, P 均 0.05),見圖 IE、 Fo二、3-arrestin2的缺失減輕小鼠急性UC的炎癥反應(yīng) 小鼠自由飲用3%DSS7d后，收集小鼠部分結(jié)腸組織并制

32、備成石蠟標(biāo)本, HE染色結(jié)果顯示，與B-arrestin2WT實驗組比較，3 -arrestin2K0 實驗組結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度明顯減輕，炎癥細(xì)胞的浸潤減少，見圖2Ao 從第2日起至第7日，B-arrest in2Ko實驗組的疾病活動指數(shù)均低 于B-arrestin2WT實驗組，見圖2B,且從第4日起，2組疾病活動 指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0. 01)。與B-arrestin2Ko實驗 組比較，3-arrestin2WT實驗組造模后結(jié)腸長度縮短更為明顯，差 異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6. 441, P0. 001),見圖2C、Do三、B -arrestin2的缺失下調(diào)小鼠UC結(jié)腸黏膜和HCoEpiC細(xì)胞中的 自噬水平6 -arrestin2K0實驗組Beclinl表達(dá)水平較8 -arrestin2WT實驗組 明顯減少(圖3A),蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，B-arrestin2Ko 實驗組和8 -arrestin2WT實驗組的LC3BTI/I蛋白相對表達(dá)量比較 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.868, P0.01),但Beclinl表達(dá)水平比較差 異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0. 05),見圖3B、Co在人源性結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC細(xì)胞中,根據(jù)說明書使用si