流式細胞技術(shù)和其在科研中的科學應(yīng)用和意義

1、流式細胞技術(shù)和其在科研中的科學應(yīng)用和意義課程內(nèi)容第一部分 概要第二部分 儀器構(gòu)造及工作原理第三部分 技術(shù)及方法第四部分 應(yīng)用第一部分 概要1.1 基本概念流式細胞技術(shù)（Flow Cytometry, FCM） 是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析和分選的技術(shù)。(熒光顯微鏡技術(shù)的改良)流式細胞儀（Flow Cytometor, FCM）是一項集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的檢測儀器。 又稱 (Fluorecence activated cell sorter, FACS) FACSort FACSCal

2、ibur FACSVantage 1.2 技術(shù)特點 單細胞分析：任何單細胞懸液，如血液、骨髓、體液中的細胞、培養(yǎng)細胞，實體組織經(jīng)處理后制成單細胞懸液。快速分析：極短時間內(nèi)可分析大量細胞，只要標本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。1.2 技術(shù)特點多參數(shù)分析：可同時分析單個細胞的多種特征,當同時用多種分子探針,如用不同熒光素標記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色,通過流式細胞分析,即可獲得單細胞的多種信息,使細胞亞群的識別、計數(shù)等更為準確。定性或定量分析：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、

3、Ca2+濃度等均可進行單細胞水平的定性與定量分析。 第二部分 儀器構(gòu)造及工作原理2.1 儀器構(gòu)造1. 流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)2. 激光光源及光束形成系統(tǒng)3. 光學系統(tǒng)4. 信號檢測與存貯、顯示、分析系統(tǒng)5. 細胞分選系統(tǒng)2.2 工作原理1. 流動室儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430180um長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心。流動室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，并且保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。液流驅(qū)動系統(tǒng)將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本，在

4、一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，用不含細胞或微粒的緩沖液（又稱鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度，使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動，形成一個圓形的流速（即鞘流），待測細胞在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域。2.2 工作原理2.2 工作原理2. 激光光源 目前FCM大多采用氬離子氣體激光器，波長為488nm。激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。用聚焦透鏡對激光光束聚焦后，可以在照射區(qū)得到一個近似扁平的橢圓形光斑，其厚度可達20m。當流動的細胞經(jīng)過光斑時才能被激光照射并產(chǎn)生光散射和發(fā)射

5、熒光。 2.2 工作原理3. 光學系統(tǒng) FCM的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。2.2 工作原理4. 信號檢測（1）散射光信號 前向角散射(Forward Scatter, FSC ) 側(cè)向角散射(Side Scatter, SSC)（2）熒光信號前向角散射光（FSC）激光器激光器激光探測器大顆粒小顆粒側(cè)向角散射光（SSC）激光器側(cè)向散射光探測器2.2 工作原理5. 數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 FCM數(shù)據(jù)存貯的方式均采用列表排隊方式。 數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點圖等。2.2 工作原理單參數(shù)直方圖二維散點圖2.3 細胞分選原理 當

6、細胞懸液形成液流柱經(jīng)流動室，流動室上方的壓電晶體產(chǎn)生機械振動帶動流動室以相同頻率進行振動，使液流注斷裂成一連串均勻的液滴，僅少量液滴含有細胞，有大量不含細胞的空白液滴。當實驗設(shè)計中設(shè)定了被分選的細胞的特性參數(shù)時， 此類細胞在形成液滴時會被充電，使其帶有正電荷或負電荷，未被設(shè)定分選參數(shù)的細胞及空白液滴不帶電荷。帶電荷的液滴在落入電極偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場，依所帶電荷是正或是負而發(fā)生向右或向左的偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器中，完成細胞分選的目的。第三部分 技術(shù)要點3.1 熒光探針的選擇1. 根據(jù)儀器類型選擇熒光探針 FACSort 配有488nm單激光器。 FACSCalibur 配有488nm和633nm

7、雙激光器。 2. 根據(jù)熒光強度大小選擇熒光探針 各種熒光色素有不同的發(fā)射熒光強度。在多色免疫熒光分析中，應(yīng)選擇熒光強度最強的熒光色素標記的單克隆抗體，尤其是對于表達量較低抗原的分析更是如此。常用熒光染料的特性熒光染料 分子量 激發(fā)波長(nm) 發(fā)射波長(nm) 顏色 用途FITC 390 488 525 深藍 免疫熒光PE 240000 488 575 橙色 免疫熒光PerCP 35000 488 677 紅色 免疫熒光PeCy5 224000 488 670 紅色 免疫熒光PeCy7 224000 488 755 深紅色 免疫熒光PI 488 620 橙紅色 免疫熒光 APC 104000

8、633 670 紅色 免疫熒光 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC） FITC是一種最為常見的熒光探針，其分子量為389Da，用488nm的激光激發(fā)后發(fā)射熒光的峰值在520nm附近，使用53015 nm的帶通濾光片可得到最佳的熒光檢測信號。FL1探測器檢測FITC。3.1 熒光探針的選擇 藻紅蛋白 ( p-phycoerythrin,PE)PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，當使用488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對于單激光器的流式細胞儀來說，推薦使用58521nm的帶通濾光片，雙激光

9、器的流式細胞儀推薦使用57513nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。3.1 熒光探針的選擇 多甲藻葉綠素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kD，當被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測器檢測PerCP。3.1 熒光探針的選擇3.1 熒光探針的選擇 碘化丙啶 （ propidium iodide，PI） 可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時，需用RNase對細胞進行處理，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影

10、響。在488nm波長激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 在FL2探測器檢測。 FL2探測器檢測PI。3.2 免疫熒光染色直接免疫熒光染色法 多用于對細胞表面標志的染色分析。選用單克隆熒光抗體是直接針對細胞表面抗原特異性標志的單一抗體，一個抗體針對一個抗原。特異性強，熒光標記干擾因素少，但需購買多種熒光標記單抗。間接免疫熒光染色法 選用特異性單抗（一抗）與待測細胞結(jié)合后，再用熒光素標記的二抗（針對一抗的抗原特異性的）進行標記染色。適用于對一些新的未知抗原的檢測，不需要多種熒光抗體。3.4 光譜重疊的補償由于細胞或微球攜帶兩種或兩種以上熒光素，受激光激發(fā)而發(fā)射出兩種不同波長的熒光時， 理

11、論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測， 而不會檢測到另一種熒光。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同， 使用了BP（帶通）和LP（長通）濾片后， 發(fā)射光譜范圍仍有一定的重疊?？朔@種誤差最有效的方法是使用熒光補償，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。 3.4 光譜重疊的補償 設(shè)置補償?shù)幕静襟E（1）選擇標準熒光微球或正常細胞。（2）調(diào)節(jié)光電倍增管（PMT）電壓，使未染色 細胞或微球的熒光峰處于10道以內(nèi)。（3）畫出被分析細胞或微球的門或區(qū)域。（4）增加補償設(shè)置，直至陽性和陰性細胞或 微球處于最合適的位置。3.4 光譜重疊的補償3

12、.4 光譜重疊的補償3.4 光譜重疊的補償 設(shè)門（gating）是流式細胞儀分析中的一種重要技術(shù)，只有通過最佳的設(shè)門方式，才能準確地獲取和分析。 “設(shè)門” 是指在細胞分布圖中，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群。 通過“設(shè)門”得到不同的 區(qū)域（Region）。從而對其中的細胞進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。 3.5 設(shè)門策略3.5 設(shè)門策略（1）在線設(shè)門 又稱為實時設(shè)門，是指在流式細胞儀獲 取數(shù)據(jù)時就限定散射光和（或）熒光信號的范圍。在線設(shè)門對所需要實時完成的實驗，如淋巴細胞亞群和造血干/祖細胞的絕對計數(shù)、HLA-B27、細胞分選等具有重要意義。3.5 設(shè)門策略 對血液中淋巴細胞設(shè)門（R

13、1）分析其免疫表型3.5 設(shè)門策略（2）離線設(shè)門 又稱為非實時設(shè)門（non-real time gating）， 是指在流式細胞儀已獲取數(shù)據(jù)后，通過計算機軟件將數(shù)據(jù)調(diào)出，設(shè)定不同的散射光和（或）熒光信號范圍進行數(shù)據(jù)分析的設(shè)門方式。適合于一些需要多重設(shè)門并進行較為復(fù)雜分析的數(shù)據(jù)，尤其是對于一些熒光染色強度不定的樣本，可以采用較大范圍的散射光閾值設(shè)門，獲取所有信號并儲存在計算機硬盤等介質(zhì)中，再進行離線設(shè)門分析，可以更好地保持數(shù)據(jù)的完整性。3.5 設(shè)門策略白細胞和血小板的光散射設(shè)門3.5 設(shè)門策略FL2-W/FL2-A設(shè)門排除雙連體細胞對G2/M期細胞比例的影響3.5 設(shè)門策略檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞大

14、小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體第四部分 應(yīng) 用4.1 免疫表型分析用熒光素標記的單克隆抗體作為分子探針，檢測細胞上的特異性抗原分子，稱為免疫表型分析?？赏瑫r鑒別單個細胞上的多種抗原。國際人類白細胞抗原協(xié)作組（HLDA）將細胞表面抗原統(tǒng)一編號，用分化群（cluster of differentiation, CD）命名，目前已達247種。 CD分子是細胞(白細胞、紅細胞、血小板及血管內(nèi)皮細胞等)在分化成為不同譜系、不同階段細胞以及活化過程中或疾病狀態(tài)下出現(xiàn)或消失的細胞表面

15、標記。4.1.1 樣品制備血液或骨髓 采集使用EDTA-K2或EDTA-K3抗凝，抗凝劑終濃度為1.52mg/ml。標本采集后室溫保存，6h內(nèi)處理。由于標本已經(jīng)屬于單細胞懸液，不需特殊處理。但一般分析白細胞時需要用紅細胞裂解液去除紅細胞，或用特殊方法分離淋巴細胞或其他白細胞。4.1.1 樣品制備體液和各種灌洗液 新鮮采集的標本，10001500r/min離心5min，棄去上清取細胞沉淀，用含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌12次，經(jīng)50m的尼龍網(wǎng)過濾后懸浮在0.51ml PBS中待用，一般細胞濃度為（25）106/ml，當細胞數(shù)不足時可增加標本量進行濃縮。4.1.1 樣品制備各種組織細

16、胞 由于是進行免疫表型分析，應(yīng)使細胞表面抗原在處理過程中保持其抗原活性，并且不發(fā)生丟失。因此，不宜選用甲醛、乙醇等固定組織，不宜用酶、表面活性劑等處理細胞。 手工剪切法單細胞儀制備法 勻漿50um尼龍網(wǎng)過濾后，用含0.1%BSA的PBS 10002000r/min 離心5min，洗滌2次，懸浮備用。4.1.2 抗體選擇根據(jù)信噪比選擇抗體的滴度：特異性熒光信號與非特異性結(jié)合噪音（同型對照）的比值越大，表明陽性與對照熒光峰分離越好，可確定為最佳抗體滴度?？贵w組合的選擇：多種熒光素標記的單克隆抗體組合應(yīng)用之前，必須將每種抗體單獨應(yīng)用和組合應(yīng)用的結(jié)果進行比較，無差別結(jié)果時才可組合使用。組合應(yīng)用時，注意

17、抗體的稀釋度。單獨使用最佳用量為20ul，而如3種組合時，總體積增至60ul，每種抗體被稀釋，不再是最佳用量。 4.1.3 免疫熒光染色直接免疫熒光染色法： 單色免疫熒光染色法 多色免疫熒光染色法間接免疫熒光染色法： 單色免疫熒光染色法4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置陽性對照 是指用已知表達某種抗原的細胞作為樣本檢測，應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果的對照實驗。是檢查已知陽性標本能否用所測條件與方法確定為陽性，否則可能是單克隆抗體的質(zhì)量與濃度、熒光染色條件、儀器狀況等存在問題。陽性對照達不到要求時不能進行實驗。陰性對照 是指用已知不表達某種抗原的細胞作為樣本檢測，應(yīng)出現(xiàn)陰性結(jié)果的對照實驗。陰性對照試驗可以避免單克

18、隆抗體的純度不夠或特異性差等因素造成的假陽性結(jié)果。4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置同型對照 是指與單克隆抗體相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應(yīng)標記熒光素，如：IgG1 FITC、IgG2a PE等。同型對照主要考慮了細胞的自發(fā)熒光、Fc受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對照與單克隆抗體所標記的熒光色素、濃度、標記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值（F/P比值）應(yīng)該相同為最佳，這對準確設(shè)定陰性與陽性細胞的界標有重要意義，切忌使用與單克隆抗體不相匹配的同型對照，最好為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備的產(chǎn)品。

19、4.1.4 熒光染色對照的設(shè)置標本的固定與保存 固定用于延長檢測時間。熒光抗體與細胞抗原結(jié)合后，一些低親和力的抗體在洗滌過程中可能與抗原分離，或不能及時檢測，可導(dǎo)致假陰性或陽性減弱。終濃度為1%多聚甲醛，固定30分鐘。在熒光染色之后進行。24小時之內(nèi)檢測。最長可達10天。4.1.7 免疫表型分析的影響因素抗體的用量：使用抗體濃度3g/ml時，表明抗體的親和力或特異性低，最好不用。 最佳濃度一般為0.011 g/ml，相當于每個測試10100ng。非特異性結(jié)合（NSB）：是指非抗原抗體的結(jié)合。Fc受體結(jié)合抗體是導(dǎo)致其重要因素。任何細胞上只要存在未結(jié)合的Fc受體，都可能有NSB。采用高濃度的純化鼠

20、IgG可用于阻斷Fc受體的NSB。免疫球蛋白聚集可增加NSB。由于冰凍、復(fù)溶和凍干處理，抗體均可出現(xiàn)聚集。對于新近購買的抗體，可通過高速離心去除聚集。 抗原抗體反應(yīng)溫度：一般在室溫條件下進行。死細胞：可增加抗體的非特異結(jié)合。因此，標本采集后應(yīng)盡快進行熒光染色，固定后的保存時間可相對較長。此外，也可在標本制備前計數(shù)死細胞的百分率。4.2 細胞周期與DNA倍體分析在生物細胞核中，DNA含量并非恒定，隨細胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。整個細胞周期從DNA含量變化可以描述為G0/G1、S、G2/M期三個細胞峰。G0/G1期細胞的DNA含量相同，均為二倍體DNA含量。G2/M期細胞的DNA含量均為四倍體

21、DNA含量。4.2 細胞周期與DNA倍體分析 4.2.1 FCM分析的基本方法熒光染料（如PI）與細胞DNA分子特異結(jié)合，而且有一定的量效關(guān)系，即DNA含量的多少與熒光染料結(jié)合量成正比，熒光強度與熒光直方圖的通道數(shù)成正比。在流式細胞分析DNA中，只有在染色體數(shù)目變化引起DNA含量與正常細胞有差異時，才可能有DNA異倍體檢出。在DNA含量未見異常并不能除外染色體異常的存在。 4.2.2 DNA含量的表示方法細胞群的DNA含量在FCM分析中一般以DNA指數(shù)（DNA index，DI）表示其相對含量，一個正常的二倍體細胞峰，其 G0/G1期細胞DNA含量為2C，DI值。DI=樣本G0/G1期細胞峰平

22、均熒光道數(shù)/正常二倍體標準細胞G0/G1期細胞峰平均熒光道數(shù)4.2.1 DNA倍體的判定標準倍體（ploidy）原指染色體數(shù)目。流式細胞分析中用來描述總的 DNA總量。根據(jù)DI判定DNA倍體。 （）為二倍體 （）為近二倍體 （）為四倍體 DI為多倍體 其余DI值均為非整倍體1. 單細胞懸液制備 新鮮或新鮮冰凍標本： 白血病標本、穿刺液很容易獲得單細胞懸液。實體腫瘤可在含去污劑的緩沖液中手工機械處理，細胞核可釋放至懸液中。新鮮固定的標本： 標本切成12mm2的小塊，在含胃蛋白酶的液中孵育或用胰蛋白酶處理，使其釋放細胞核。甲醛固定、石蠟包埋的標本： 從包埋組織上切片至少50m厚，太薄的切片會含有太

23、多切碎的核，從而增加DNA直方圖的碎片干擾。組織切片被脫蠟、經(jīng)過乙醇處理并水化后，用蛋白水解酶處理，使其釋放細胞核。4.2.2 樣本制備2 固定 采用70%預(yù)冷乙醇(04C)。運送標本時應(yīng)保證樣本完全浸沒在固定劑中。由于PI不能通過活細胞進入胞內(nèi)染色，因此要用乙醇將細胞膜打孔，把染料引入胞內(nèi)并將細胞固定。若同時使用抗體鑒別細胞應(yīng)選擇對抗原無損的固定劑，并在抗體標記之后進行固定。4.2.2 樣本制備4.2.2 樣本制備3染色 應(yīng)用PI染色液。染料要足夠，以保證飽和結(jié)合。PI的推薦濃度至少為20ug/106細胞。由于PI也與雙鏈RNA結(jié)合，分析前樣本應(yīng)用RNase處理。細胞用50um尼龍網(wǎng)過濾后上

24、機檢測。4細胞濃度 單細胞或細胞核的最終濃度應(yīng)為 106/ml。濃度太低時，流式細胞儀檢測室樣本的流速不得不提高，從而使CV增大。如果細胞或細胞核濃度太高，則可能導(dǎo)致染料的相對不足，影響CV和檢測結(jié)果。 流式細胞分析的高分辨率或精密度可檢出不同細胞群體DNA含量的細微差別，通常的檢測分辨率或精密度由DNA含量直方圖中G0/G1峰的變異系數(shù)（CV）來反映。CV越小，質(zhì)量越好。新鮮標本CV常3%，石蠟包埋標本的CV5%。4.2.2 樣本制備4.2.2 樣本制備5樣本制備的質(zhì)量 制備完成后的標本可用光學顯微鏡檢查其質(zhì)量，注意觀察： 樣本中細胞或細胞核濃度 細胞聚集或過多的碎片 大多數(shù)核有腫瘤樣的外觀 分離的核上沒有參與細胞質(zhì)附著4.2.3 樣本分析4.3 細胞凋亡檢測細胞凋亡(Apoptosis)是指有核細胞在一定條件下，通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細胞死亡過程。 4.3.1 細胞凋亡的生化特征Caspase 蛋白酶和絲氨酸蛋白酶激活：核酸內(nèi)切酶激活：DNA電泳出現(xiàn)“梯狀”改變。線粒體