第二章組織培養(yǎng)基本技術(shù)ppt課件

1、第二章 植 物 組 織 培 養(yǎng) 基 本 技 術(shù)第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及根本技術(shù)第二節(jié) 組織培育所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分第三節(jié) 培育基的配制與滅菌第四節(jié) 外植體的選擇和滅菌第五節(jié) 外植體的接種和培育第六節(jié) 外植體的褐變及其預(yù)防措施第七節(jié) 玻璃化景象及其預(yù)防措施第八節(jié) 試管苗的馴化和移栽第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及根本技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)室組成二、儀器設(shè)備三、培育器皿及實(shí)驗(yàn)器具四、洗滌技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無菌操作 組織培育實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于察看一、實(shí)驗(yàn)室組成根本實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成預(yù)備室緩沖室無菌操作室培育室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫 室生化分析實(shí)驗(yàn)室根本實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃平面圖實(shí)驗(yàn)臺擱架

2、培育架培育架培育架培育架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m預(yù)備室緩沖室無菌室培育室組織培育預(yù)備實(shí)驗(yàn)室緩沖室培育室無菌室一無菌室二二、儀器設(shè)備1、根本儀器設(shè)備 6912 8 冰箱、電磁爐、酸度計(jì)、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培育箱、搖床、生化培育箱、培育基分裝器、攪拌器等。冰箱酸度計(jì)電爐天平純水器培育基分裝器攪拌器2、滅菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌安裝、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋干熱消毒柜無菌瓶頂過濾安裝噴霧消毒器參考圖參考圖3、無菌操作設(shè)備 超凈任務(wù)臺無菌接種箱4、細(xì)胞培育設(shè)備 搖 床培育架HZC-250恒溫振蕩培

3、育箱 150C250D光照培育箱 5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備 光學(xué)顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡1、玻璃器皿三、培育器皿及實(shí)驗(yàn)器具培育皿三角瓶培育瓶2、金屬材質(zhì)器具鑷子解剖刀接種針?biāo)?、洗滌技術(shù)1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿2、塑料用品洗滌新的塑料器皿翻開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干五、滅菌技術(shù)物理方法： 物理滅菌干熱、濕熱、射線處置、過濾除菌等化學(xué)方法： 消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法2、滅菌1培育基滅菌：高

4、溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104Pa 溫度在121 滅菌2030min2玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力溫度（）飽和蒸汽壓力溫度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.63塑料器皿

5、滅菌： 多采用高壓蒸汽消毒滅菌4金屬器具滅菌：灼燒滅菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后運(yùn)用5接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈任務(wù)臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培育資料的接種紫外燈照射6外植體滅菌流水沖洗1020min或更長時(shí)間70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗45次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時(shí)間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易較難易中較難53

6、05305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較好好六、無菌操作實(shí)驗(yàn)員消毒實(shí)驗(yàn)室、無菌臺滅菌實(shí)驗(yàn)器材的滅菌無菌接種消 毒實(shí)驗(yàn)臺衛(wèi)生培育室培育1、消毒，改換實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。2、翻開超凈任務(wù)臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后封鎖。3、開啟過濾室風(fēng)機(jī)，使無菌風(fēng)吹拂任務(wù)臺面和周圍的臺壁。4、用70%75%的酒精擦拭任務(wù)臺和雙手。5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培育基的培育器皿，放進(jìn)任務(wù)臺。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種資料。8、翻開瓶口，用火焰燒瓶口，

7、轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口使瓶口各部分都燒到。9、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培育資料放入培育瓶，蓋上瓶口。11、接種終了后，清理和封鎖超凈任務(wù)臺。留意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭任務(wù)臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第二節(jié) 植物組織培育所需的環(huán)境 條件及營養(yǎng)成分一、環(huán)境條件 與自然條件一樣，組織培育中的外植體的生長要遭到溫度、光照、濕度等各種物理?xiàng)l件，不同氣體、培育基的組成、pH值和浸透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體部位、大小、細(xì)胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需求來控制培育條件是組織培育中的一個(gè)重要問題。溫度光照濕度氣體浸透壓pH值普通最適溫度在25

8、2之間環(huán)境條件最常用的是光照16h，黑暗8h 普通情況下，培育器內(nèi)相對濕度應(yīng)達(dá)100%，培育室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%80% 氧氣是愈傷組織生長所必需的 調(diào)理浸透壓經(jīng)常從糖入手 培育基的pH值大多在5.06.5，5.8二、營養(yǎng)成分 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為構(gòu)造物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活潑的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn) 定、電荷平衡點(diǎn)等化學(xué)方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形狀發(fā)生和組織、 器官建成。Arnon和Stout1939提出確實(shí)定植物必

9、需營養(yǎng)元素的3個(gè)規(guī)范:阿隆和斯托德 A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生妨礙，不能完成其生活史;B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專注的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充該元素來預(yù)防和恢復(fù);C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改良而產(chǎn)生的間接效果。 國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有1617種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、Ni 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)分量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等

10、9種微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)分量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會(huì)的建議： 所需濃度 0.5mmol/L的元素為大量元素 所需濃度 0.5mmol/L的元素為微量元素1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培育基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有親密關(guān)系。Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體構(gòu)造具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分

11、，對細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜構(gòu)造有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。2、微量元素 在微量元素中，鐵的運(yùn)用最大： 一些氧化酶的組成成分 葉綠素構(gòu)成的必要條件 運(yùn)用乙二胺四乙酸鐵EDTA-Fe鰲合物防止鐵的沉淀 硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著親密的關(guān)系 銅是某些氧化酶的成分，可以促進(jìn)離體根的生長 錳參與植物的光合、呼吸代謝 鉬參與氮素的代謝 氯是光協(xié)作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)理。缺鐵病癥：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢開展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。 桃樹缺銅病癥： 新梢頂端葉片的

12、葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)展變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長不良，其下部的芽開場生長，構(gòu)成叢生的細(xì)枝。 菊花缺錳病癥： 葉脈間失綠褪色，但葉脈仍堅(jiān)持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素病癥由幼葉開場。 菜豆梨缺錳癥缺鉬病癥：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。 白菜缺硼病癥： 受精不良，籽粒減少 ，“花而不實(shí)， “蕾而不花； 根尖、莖尖的生長點(diǎn)停頓生長，而構(gòu)成簇生狀； 常引起各種腐爛病。 馬鈴薯缺鋅病癥： 小葉病，葉片變小，兩節(jié)之間縮短。葉脈間失去綠色或者變白。植物缺素癥缺氮：首先表如今老葉上均一的缺綠景象；缺磷：老葉片發(fā)藍(lán)稍

13、帶紫色，葉緣變?yōu)樽霞t色，葉尖枯死；缺鉀：先表如今老葉斑駁的缺綠病癥葉緣枯黃，卷曲伸展，莖的節(jié)間變短；缺鈣：新葉葉片變小、枯死，即干燒心；缺硫：首先表現(xiàn)為新葉葉片缺綠或發(fā)紫；缺錳：新葉脈間失綠；缺鐵：葉片黃，葉脈綠；缺硼：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝；缺鋅：老葉脈間缺綠，出現(xiàn)白色壞死斑；缺銅：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴(yán)重整葉萎蔫過早零落；缺鉬：不能構(gòu)成花器或花早落。 3、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點(diǎn)： 具有遇熱易變 利于吸收和利用 運(yùn)用濃度普通在2%-5% 提供能源和調(diào)理浸透壓 4、維生素類 以各種輔酶的方式存在 參與多種代謝活動(dòng)

14、 對生長，分化等有很好的促進(jìn)作用 主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素 常用維生素有VB1和VB6 5、肌醇 環(huán)己六醇 細(xì)胞壁的構(gòu)建資料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng) 促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揚(yáng)作用6、氨基酸 蛋白質(zhì)的組成成分 有機(jī)氮源 可直接被細(xì)胞吸收利用 培育基中常用的是甘氨酸7、天然復(fù)合物 促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長 化學(xué)成分不明、復(fù)雜 天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、瓊脂 是運(yùn)用最普遍的凝固劑用量普通在6-10g/L之間顏色以淺、透明度高的好，干凈為上品 除了瓊脂外，在組織培育中還可以運(yùn)用卡拉膠、瓊脂糖、結(jié)冷膠等。9、活性炭 吸附培育基及培育物分泌物中的抑制

15、物質(zhì) 抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進(jìn)培育物生長和分化 促進(jìn)生根10、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌呵斥的污染活性炭11、生長素類 促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂 促進(jìn)生根、抑制器官零落、性別控制、延伸休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實(shí) 誘導(dǎo)愈傷組織構(gòu)成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生長素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)12、細(xì)胞分裂素類 促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的構(gòu)成 延緩組織的衰老并加強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于0.5-1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細(xì)胞分裂素： K

16、T (激動(dòng)素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素類和零落酸 A、赤霉素類 組織培育中不常運(yùn)用 加速細(xì)胞的伸長生長 促進(jìn)細(xì)胞的分裂 主要是GA3 B、零落酸(ABA) 抑制細(xì)胞分裂和伸長 促進(jìn)零落和衰老 促進(jìn)休眠和提高抗逆才干培育基形狀不同：固體培育基、液體培育基培育過程不同：初代培育基、繼代培育基其作用不同：誘導(dǎo)培育基、增殖培育基、生根培育基 營養(yǎng)程度不同：根本培育基、完全培育基一、培育基的種類第三節(jié) 培育基的配制、滅菌與保管1、MS培育基 無機(jī)鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富 不需求添加更多的有機(jī)附加物二、幾種常見培育基

17、的特點(diǎn)2、White培育基 1943年由White為培育番茄根尖而設(shè)計(jì) 1963年作了改良，提高M(jìn)gSO4的濃度和添加硼元素 無機(jī)鹽濃度較低 運(yùn)用廣泛 在生根培育、胚胎培育中有良好的效果大量元素含量微量元素含量鐵鹽含量有機(jī)物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0鹽酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：

18、White培育基3、B5培育基 1968年由Gamborg等為培育大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì) 含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分 數(shù)量(mg/l）組成成分 數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動(dòng)素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025

19、 鹽酸硫銨素 10 Na2-EDTA37.3 B5培育基的組成和配方4、N6培育基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培育設(shè)計(jì) KNO3和NH4SO4含量高，不含鉬組成成分 數(shù)量(mg/l) 組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培育基組成及配方

20、配制培育基應(yīng)做好幾點(diǎn)任務(wù)：1、實(shí)驗(yàn)器具的預(yù)備。包括配制過程中所需電爐、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和預(yù)備.2、試劑、藥品的預(yù)備3、根據(jù)培育基的配方、母液擴(kuò)展倍數(shù)及需求配制的培育基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量三、培育基的配制詳細(xì)操作如下：1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2、根據(jù)計(jì)算所需量依次參與大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)理物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻；3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻；4、調(diào)整培育基的pH值；5、分裝倒；6、封口擰蓋。 組織培育必需在無菌環(huán)境中進(jìn)展，因此培育基的滅菌操作非常重要。 培育

21、基分裝封口后立刻進(jìn)展滅菌，至少在24h內(nèi)完成滅菌程序。 普通采用的是高壓蒸汽滅菌。四、培育基的滅菌 滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，運(yùn)用時(shí)要留意一下幾點(diǎn)：1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免呵斥空燒或干燒；2、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可堅(jiān)持內(nèi)部有一定的空 間，利于蒸汽流動(dòng)；3、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必需排凈，否那么易影響 滅菌效果；4、滅菌過程中，應(yīng)盡量堅(jiān)持壓力恒定，嚴(yán)厲遵守滅菌時(shí)間；5、排氣降壓時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)展；6、只需待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，才干開啟壓力鍋；7、高壓鍋任務(wù)時(shí)，應(yīng)有專人看守。高壓滅菌的原理在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度

22、也隨之添加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。 本卷須知 完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才干徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：封鎖放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，翻開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再封鎖放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升到達(dá)0.1MPa時(shí),開場計(jì)時(shí)，維持壓力0.10.15MPa 20分鐘。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效能比干熱大，其緣由有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量添加，所需凝固溫度降低

23、，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出226kJ千焦的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而添加滅菌效能。 在運(yùn)用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除能否完全極為重要，由于空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。 假設(shè)壓力未降到0時(shí)，翻開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力忽然下降，使容器內(nèi)的培育基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，呵斥棉塞沾染培育基而發(fā)生污染。 滅菌后的培育基經(jīng)冷卻和凝固后即可運(yùn)用檢驗(yàn)滅菌效果。 檢驗(yàn)方法： 將培育基置于培育室中3天，假設(shè)沒有

24、污染景象，闡明滅菌可靠，可以運(yùn)用。 保管在低溫條件下。常溫下保管時(shí)要進(jìn)展防塵和避光處置。 保管時(shí)間不可過長。五、培育基的保管第四節(jié) 外植體的選擇和滅菌 一、 外植體的選擇 二、 外植體的滅菌方法 三、 污染緣由和預(yù)防措施 一、外植體的選擇 植物組織培育的主要過程大致包括：外植體的選擇、培育基的制備、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。 1、選擇優(yōu)良的種質(zhì) 無論是離體培育繁衍種苗，或者是進(jìn)展生物技術(shù)研討，培育資料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或特殊的基因型。對資料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高勝利機(jī)率，添加其適用價(jià)值。 2、選擇強(qiáng)壯的植株 組織培育用的資料，最好

25、從生長強(qiáng)壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。由于這些器官或組織代謝旺盛，再生才干強(qiáng)，比較容易培育勝利。3、選擇最適的時(shí)期 組織培育選擇資料時(shí)，要留意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。如快速繁衍時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。4、選取適宜的大小 建立無菌資料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物資料而異。資料太大易污染，也不需求；資料太小，多構(gòu)成愈傷組織，甚至難于成活。普通選取培育資料的大小，在0.5cm-1.0cm。假設(shè)是胚胎培育或脫毒培育的資料，那么應(yīng)更小。二、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的運(yùn)用和效果2、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的運(yùn)用和效

26、果滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時(shí)間效 果次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好漂 白 粉飽和濃度易530很好氯 化 汞0.11較難210最好酒 精7075易0.22好過氧化氫1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 銀1較難530好抗 菌 素450mg/L中3060較好2、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)展預(yù)處置。植物資料普通采取的預(yù)處置方法是：先對植物組織進(jìn)展修整，去掉不需求的部分，將預(yù)備運(yùn)用的植物資料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處置的植物資料，其外表仍有很多細(xì)菌和真菌，因此還需進(jìn)一步滅菌。 常規(guī)的外表滅菌處置方法把資料放進(jìn)70%的酒精中約30

27、s。用0.1%的升汞HgCl2浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸鈉溶液浸泡10 15min。無菌蒸餾水沖洗35次。滅菌時(shí)進(jìn)展攪動(dòng)，使植物資料與滅菌劑有良好 的接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的Tween20吐溫 或Tween80潮濕劑，那么滅菌效果更好。 三、污染緣由和預(yù)防措施1、污染的緣由污染是指在組織培育過程中培育基和培育資料繁殖雜菌，導(dǎo)致培育失敗的景象。污染的緣由：從病原菌方面來分析主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培育基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。細(xì)菌污染的特點(diǎn)：是在資料附近的培育基中出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡。普通在接種后12天即

28、可發(fā)現(xiàn)。緣由：資料帶菌； 培育基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規(guī)程。因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在運(yùn)用前必需在火焰上燒紅。真菌污染的特點(diǎn)：培育瓶內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后310天才干發(fā)現(xiàn)。緣由：周圍環(huán)境不清潔； 超凈任務(wù)臺的過濾安裝失效； 培育瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，提高任務(wù)效率，必需在每個(gè)操作環(huán)節(jié)留意防止污染的發(fā)生。 2、污染的預(yù)防措施發(fā)現(xiàn)污染的資料應(yīng)及時(shí)處置，否那么將導(dǎo)致培育室環(huán)境污染。對一些特別珍貴的資料，可以取出再次進(jìn)展更為嚴(yán)厲的滅菌，然后接入新穎的培育基中重新培育。要處置的污染培育瓶最好在翻開瓶蓋前，先集中進(jìn)展高壓滅菌，

29、再去除污染物，然后洗凈備用。現(xiàn)就根據(jù)污染途徑，論述污染的幾個(gè)預(yù)防措施:1防止資料帶菌的措施1用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對 枝條先進(jìn)展預(yù)培育。枝條 水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水 抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少資料的污染。在無菌條件下對采自田間的枝條進(jìn)展暗培育，待 抽出徒長的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明 顯減少污染。 2選擇適宜的時(shí)間去田間采取外植體防止陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因資料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌。 但目前對資料內(nèi)部污染還沒有令人稱心的滅菌方法。在菌類長入組織內(nèi)部時(shí)，不但要除去

30、上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污染效果。2外植體的滅菌1多次滅菌法： 首先除去主脈因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在； 其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中，滅菌30min； 第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-5次； 第四，將資料封鎖在無菌的培育皿中過夜，堅(jiān)持一定溫度； 第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后用蒸餾水洗3-5次。2多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的資料：首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，外表不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片；第2，將資料放入70%酒精中滅菌數(shù)

31、秒鐘；第3，在1：500Roccal B一種商品滅菌劑名稀釋液中浸5min；第4，放入5%10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80數(shù)滴，滅菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并參與“吐溫80數(shù)滴，滅菌510min；第5，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的0.1M鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。 3玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)展高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延伸達(dá)25min30min。干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)展滅菌。煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)展滅菌。4金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一

32、下，然后放在火焰上熄滅滅菌。這一步驟該當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)展。干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。濕熱滅菌法：任務(wù)服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，121C的溫度，滅菌20 min30min。5布質(zhì)制品的滅菌 6無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和任務(wù)臺的滅菌可用2%的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20-30min。運(yùn)用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。7操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)厲按照無菌操作的程序進(jìn)展在接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉

33、溶液洗手，最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母種瓶外表進(jìn)展消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈任務(wù)臺。任務(wù)人員在接種時(shí)，最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動(dòng)作要熟練、動(dòng)作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時(shí)間，減少污染。如脫毒培育抽取莖尖很小，操作時(shí)間長了就會(huì)使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。 小 結(jié)第一節(jié) 外植體的選擇 ：優(yōu)良種質(zhì)、強(qiáng)壯植株 、最適的時(shí)期、適宜的大小。 第二節(jié) 外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的運(yùn)用及其效果 、外植體的滅菌方法。第三節(jié) 污染緣由和預(yù)防措施：污染的緣由、污染的預(yù)防措施防止資料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、

34、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)厲按照無菌操作的程序進(jìn)展。 第五節(jié) 外植體的接種和培育 一、 外植體的接種 二、 培育條件 一、外植體的接種 外植體的接種是把經(jīng)過外表滅菌后的植物資料在無菌環(huán)境中切割或分別出器官、組織、細(xì)胞并轉(zhuǎn)入到無菌培育基上的全部操作過程。 操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和任務(wù)人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別留意防止任務(wù)人員本身引起的污染。整個(gè)接種過程均須無菌操作：1操作人員需穿著經(jīng)消毒的白色任務(wù)服，戴口罩、帽子、鞋套。進(jìn)入接種室前，雙手必需進(jìn)展消毒，用肥皂和水洗滌能到達(dá)良好的效果, 進(jìn)展操作前再用70%的酒精擦洗雙手。2操作期間經(jīng)常用70%

35、的酒精擦拭雙手和臺面。特別留意防止“雙重傳送的污染，例如器械被手污染后又污染培育基等。3在翻開培育瓶、三角瓶或試管時(shí)，最大的污染危險(xiǎn)是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)，處理這個(gè)問題，可在翻開前用火焰燒瓶口。假設(shè)培育液接觸了瓶口，那么瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細(xì)菌。為防止灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機(jī)會(huì)。4工具用后及時(shí)消毒，防止交叉污染。5任務(wù)人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在安靜呼吸時(shí)細(xì)菌是很少的，但是說話或咳嗽時(shí)細(xì)菌便增多，因此操作過程應(yīng)制止不用要的說話并戴上口罩。6由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要留意防止灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)

36、翻開瓶子或試管時(shí)，應(yīng)拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等器具，普通在運(yùn)用前浸泡在95%酒精中，用時(shí)在火焰上消毒，待冷卻后運(yùn)用。每次運(yùn)用前均需進(jìn)展器具消毒。 二、外植體的培育條件 接種后的外植體應(yīng)送到培育室去培育。組織培育的優(yōu)點(diǎn)之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培育物生長發(fā)育，研討植物的生命活動(dòng)。培育室的培育條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進(jìn)展調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培育基的pH值等。1、光照 對離體培育物的生長發(fā)育，光照條件有重要的作用。通常對愈傷組織的誘導(dǎo)，在黑暗條件下有利，在有光條件下培育的愈傷組織質(zhì)地和顏色也有不同。但分化器官需求光照，并隨著芽苗的生長需求加強(qiáng)光

37、照。加強(qiáng)光照，可以使小苗生長強(qiáng)壯，促進(jìn)“異養(yǎng)向“自養(yǎng)轉(zhuǎn)化，提高移植的成活率。普通培育室要求每日光照12h-16h，光照強(qiáng)度1000lx-5000lx。假設(shè)培育資料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適宜的黑色資料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培育。 2溫度 離體培育中對溫度的調(diào)控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度，大多數(shù)植物最適溫度在23C-32C之間。培育室普通所用的溫度是25C2C。低于15C或高于35C，對生長都是不利的。 3濕度 組織培育中的濕度影響主要有兩個(gè)方面，一是培育容器內(nèi)的濕度，它的濕度條件?？杀ＷC100%。二是培育室的濕度，它的濕度變化隨季節(jié)和天氣而有很大變動(dòng)。濕

38、度過高過低都是不利的，過低會(huì)呵斥培育基失水而干枯，或浸透壓升高，影響培育物的生長和分化；濕度過高會(huì)呵斥雜菌滋長，導(dǎo)致大量污染。因此，要求室內(nèi)堅(jiān)持70%-80%的相對濕度。4氧氣 植物組織培育中，外植體的呼吸需求氧氣。在液體培育中，振蕩培育是處理通氣的良好方法。第六節(jié)外植體的褐變及其預(yù)防措施一、褐變的概念二、褐變的緣由三、褐變的影響要素四、褐變的預(yù)防措施葡萄嫩莖接種48h馬鈴薯莖尖接種40d 褐變：是指外植體在培育過程中本身組織從外表向培育基釋放出褐色物質(zhì)，以致培育基逐漸變成褐色，外植體也進(jìn)一步變褐而死亡的景象。一、褐變的概念 褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關(guān)

39、系。酚類很不穩(wěn)定，溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類又會(huì)在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失活，從而導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長停滯不前，最終衰老死亡。 二、褐變的緣由 植物資料不同，褐變的程度有所不同。三、影響褐變的要素棗蝴蝶蘭蘋果環(huán)境、培育基、轉(zhuǎn)接周期不同，褐變的程度不同。1、植物資料1基因型 不同種植物，同種植物不同類型、不同種類在組織培育中褐變發(fā)生的頻率、嚴(yán)重程度都存在很大差別。木本植物木質(zhì)素、單寧含量或色素含量高的植物容易發(fā)生褐變。這是由于酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素的合成前體，酚類化合物含量高

40、，木質(zhì)素、單寧或色素構(gòu)成就多，而酚類化合物含量高將導(dǎo)致褐變的發(fā)生，因此，木本植物普通比草本植物容易發(fā)生褐變。蘋 果苜 蓿 2資料年齡 幼齡資料普通都有比成齡資料褐變輕的趨勢。幼齡資料褐變較輕與其酚類化合物含量少有關(guān)。Chever 分析歐洲栗的酚類含量變化的結(jié)果闡明，幼齡資料酚類化合物含量少，而成齡資料比較多。平吉成從山定子剛長成的實(shí)生苗上切取莖尖進(jìn)展培育，接種后褐變很輕，隨著苗齡增長，褐變逐漸加重，取自成齡樹上的莖尖褐變就更嚴(yán)重。梨一年生枝、二年生枝接種3d3取材部位 Yu和Meredith在葡萄上發(fā)現(xiàn)從側(cè)生蔓切取莖尖進(jìn)展培育，比從延伸蔓切取的莖尖更容易成活，進(jìn)一步分析酚類含量發(fā)現(xiàn)前者比后者少

41、。而蘋果那么頂芽作外植體褐變程度輕，比側(cè)芽容易成活。石竹和菊花也是頂端莖尖比側(cè)芽莖尖更容易成活。 4取材時(shí)期 多酚氧化酶活性和酚類含量根本是對應(yīng)的，春季較弱，隨著生長季節(jié)的到來，酶活性逐漸加強(qiáng)，因此有人以為取材時(shí)期比取材部位更加重要。Chever報(bào)道，歐洲栗在3月15日-30日醌類物質(zhì)構(gòu)成少，而在5月-6月醌類物質(zhì)明顯提高。 蔣迪軍和牛建新報(bào)道，金冠蘋果莖尖小于0.5mm時(shí)褐變嚴(yán)重,當(dāng)莖尖長度在5mm-15mm時(shí)褐變較輕,成活率可達(dá)85%。在多個(gè)蘋果種類上實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明，用5mm-10mm長的莖尖進(jìn)展培育效果最好，莖尖假設(shè)太小很容易發(fā)生褐變。另外，取外植體時(shí)還要思索其粗度，細(xì)的可切短些，粗的可切

42、得長些。 5外植體大小 主要是光照與溫度。溫度過高或光照過強(qiáng)，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體的褐變。2、培育條件 1培育基形狀 由于培育基中瓊脂的用量和pH值的高低不同，培育基可配成固體培育基、半固體培育基或液體培育基。許多實(shí)驗(yàn)證明，液體培育基可以有效抑制外植體褐變，液體培育基再加上濾紙橋，效果就更好。在液體培育基中，外植體溢出的有毒物質(zhì)可以很快分散，因此對外植體呵斥的損傷較輕。3、培育基2無機(jī)鹽 在初代培育時(shí)，培育基中無機(jī)鹽濃度過高，酚類物質(zhì)將會(huì)大量外溢，導(dǎo)致外植體褐變。緣由是無機(jī)鹽中的有些離子，如Mn2+、Cu2+是參與酚類合成與氧化酶類的組成成分或輔因子，因此鹽濃度過高會(huì)添加

43、這些酶的活性，酶又進(jìn)一步促進(jìn)酚類合成與氧化。 3植物生長調(diào)理物質(zhì) 初代培育處在黑暗條件下，生長調(diào)理物質(zhì)的存在是影響褐變的主要緣由，此時(shí)去除生長調(diào)理物質(zhì)可減輕褐變。細(xì)胞分裂素6-BA或KT不僅能促進(jìn)酚類化合物的合成，而且還能刺激多酚氧化酶的活性，這一景象在甘蔗的組織培育中明顯。而生長素類如2，4-D和IAA可延緩酚類化合物的合成，減輕褐變景象發(fā)生。 4抗氧化劑 培育基中參與抗氧化劑可改動(dòng)外植體周圍氧化復(fù)原電勢，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。 5吸附劑 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP作為吸附劑可以去除酚類氧化呵斥的毒害效應(yīng)，這在東北紅豆杉、豬籠草、鶴望蘭、杜鵑花、蘋果、桃和倒掛金鐘等植物上都有過報(bào)道。

44、在倒掛金鐘莖尖培育中只參與0.01%PVP便對褐變有抑制造用。 6pH值 培育基的pH值較低時(shí)，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，從而抑制褐變。而pH值升高那么明顯加重褐變。4、資料轉(zhuǎn)瓶周期 對于易褐變的資料，接種后轉(zhuǎn)瓶時(shí)間長，傷口周圍積累醌類物質(zhì)增多，褐變加重，以致全部死亡。而縮短轉(zhuǎn)瓶周期可減輕褐變。在山月桂樹的莖尖培育中，接種后12h24h，便轉(zhuǎn)入液體培育基中，這之后的一周內(nèi)，每天轉(zhuǎn)一次瓶，褐變得到完全控制。在無刺黑莓上也有類似閱歷 。四、褐變的預(yù)防措施1選擇適宜的外植體 外植體應(yīng)選擇分生才干較強(qiáng)的資料。如采用實(shí)生苗莖尖、枝條頂芽、幼胚等資料培育褐變程度比較輕。2采用適宜的培育基和光溫條件

45、 培育基的無機(jī)鹽成分、蔗糖濃度、激素程度、溫度適宜及在黑暗條件下培育，或在取外植體之前對母株進(jìn)展遮光處置20d40d，可以顯著減輕資料的褐變。 3在培育基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑 在培育基中參與0.1%0.5%的活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯。在許多熱帶樹木的組織培育中均曾察看到活性炭防止外植體褐變的明顯效果。如在培育基中加抗壞血酸、血潔白蛋白、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等抗氧化劑和其他抑制劑，或用它們進(jìn)展資料的預(yù)處置或預(yù)培育，可有效地預(yù)防醌類物質(zhì)的構(gòu)成。4縮短轉(zhuǎn)瓶周期 這是組培中控制褐變常用且有效的方法。第七節(jié) 玻璃化景象及其預(yù)防措施一、玻璃化景象 是指組培苗出現(xiàn)葉、嫩梢呈水晶透明或

46、半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片伸展成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮短少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低的景象。 二、玻璃化苗的危害性 由于其組織畸形，吸收養(yǎng)料與光合器官功能不全，分化才干大大降低，因此很難繼續(xù)用作繼代培育和擴(kuò)展繁衍的資料；加上生根困難，很難移栽成活。 三、玻璃化的緣由 玻璃化的原因是細(xì)胞生長過程中的環(huán)境變化。試管苗為了順應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。 產(chǎn)生玻璃化苗的要素主要有激素濃度、瓊脂用量、溫度、離子程度、光照時(shí)間、通風(fēng)條件等。1、激素濃度 激素濃度添加尤其是細(xì)胞分裂素濃度提高或細(xì)胞分裂素與生長

47、素比例高，易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。 2、瓊脂濃度 培育基中瓊脂濃度低時(shí)玻璃化苗比例添加，水浸狀嚴(yán)重，苗向上長。隨著瓊脂濃度的添加，玻璃化苗比例減少，但由于硬化的培育基影響了營養(yǎng)的吸收，試管苗生長減慢，分蘗亦減少。因此，瓊脂的濃度一定要適當(dāng)。 3、溫度 適宜的溫度可以使試管苗生長良好，當(dāng)溫度低時(shí)，容易構(gòu)成玻璃化苗，溫度越低玻璃化苗的比例越高。溫度高時(shí)玻璃化苗減少，且發(fā)生的時(shí)間較晚。 4、光照時(shí)間 不同的植物對光照的要求不同，滿足植物的光照時(shí)間，試管苗才干生長正常。大多數(shù)植物在12h14h光照下都能生長良好，光照時(shí)數(shù)大于16h時(shí)，玻璃化苗的比例明顯添加。 5、通風(fēng)條件 試管苗生長期間，要求有足夠的氣

48、體交換，氣體交換的好壞取決于生長量、瓶內(nèi)空間、培育時(shí)間和瓶蓋種類。在一定容量的培育瓶內(nèi)，愈傷組織和試管苗生長越快，越容易構(gòu)成玻璃化苗。假設(shè)培育瓶容量小，氣體交換不良，易發(fā)生玻璃化。 6、離子程度 植物生長需求一定的礦物質(zhì)營養(yǎng)，但是，假設(shè)營養(yǎng)離子之間失去平衡，試管苗生長就會(huì)遭到影響。植物種類不同，對礦物質(zhì)的量、離子形狀、離子間的比例要求不同。假設(shè)培育基中離子種類及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會(huì)添加。 四、預(yù)防玻璃化的措施1適當(dāng)控制培育基中無機(jī)營養(yǎng)成分 大多數(shù)植物在MS培育基上生長良好，玻璃化苗的比例較低，主要是由于MS培育基的硝態(tài)氮、鈣、鋅、錳的含量較高的緣故。適當(dāng)添加培育基中鈣、鋅、

49、錳、鉀、鐵、銅、鎂的含量，降低氮和氯元素比例，特別是降低銨態(tài)氮濃度，提高硝態(tài)氮濃度，可減少玻璃化苗的比例。2適當(dāng)提高培育基中蔗糖和瓊脂的濃度 適當(dāng)提高培育基中蔗糖的含量，可降低培育基中的浸透勢，減少外植體從培育基中可獲得的水分；而適當(dāng)提高培育基中瓊脂的含量，可降低培育基的襯質(zhì)勢，呵斥細(xì)胞吸水阻遏，也可降低玻璃化。如將瓊脂濃度提高到1.1%時(shí)，洋薊的玻璃化苗完全消逝。襯質(zhì)勢因襯質(zhì)成分外表吸附力(細(xì)胞膠體物質(zhì)親水性和毛細(xì)管對自在水束縛)而產(chǎn)生的水勢。由于某種緣由而降低的水化學(xué)勢而言。吸附在土壤粒子和細(xì)胞壁微纖維上的水，可分為1基于土壤粒子外表強(qiáng)有力的吸附力，主要是23層的水分子；2表現(xiàn)為來自彎月形

50、液面的外表張力的毛細(xì)管水；3外表電荷與水的氫結(jié)合所吸附的水。在這些情況下，作用力可使水的勢能降低。 浸透勢 溶液中由溶質(zhì)存在所產(chǎn)生的水勢。由于溶質(zhì)對水分子的吸附作用，使水的活性下降，所以和純水相比，含有溶質(zhì)的水做功的才干降低了，故浸透勢為負(fù)值。細(xì)胞吸水情況取決于細(xì)胞水勢，典型的水勢是由三個(gè)勢組成的：w=+p+g w為細(xì)胞水勢，為浸透勢p為壓力勢，g為重力勢。浸透勢亦稱溶質(zhì)勢浸透勢是由于溶質(zhì)顆粒的存在，降低了水的自在能，因此其水勢低于純水的水勢,這種水勢差即為浸透勢。由于純水水勢被定為零，所以浸透勢為負(fù)值。某溶液浸透勢的絕對值與該溶液浸透壓的絕對值相等。在規(guī)范壓力下，溶液的浸透勢等于溶液的水勢，

51、由于溶液的壓力勢為0MPa。溶液的的浸透勢決議于溶液中溶質(zhì)顆?？倲?shù)。 3適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度 細(xì)胞分裂素和赤霉素可以促進(jìn)芽的分化，但是為了防止玻璃化景象，應(yīng)適當(dāng)減少其用量，或添加生長素的比例。在繼代培育時(shí)，要逐漸減少細(xì)胞分裂素的含量。4添加自然光照，控制光照時(shí)間 在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，玻璃苗放在自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消逝。這是由于自然光中的紫外線能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化。光照時(shí)間不宜太長，大多數(shù)植物以10h 14h為宜；光照強(qiáng)度在1500lx1800lx之間，就此可以滿足植物生長的要求。5控制好溫度 培育溫度要適宜植物的正常生長發(fā)育。假設(shè)培育室的溫度過低，應(yīng)采取增溫措施。

52、熱擊處置，可防止玻璃化的發(fā)生。如用40熱擊處置瑞香愈傷組織培育物可完全消除其再生苗的玻璃化，同時(shí)還能提高愈傷組織芽的分化頻率。6改善培育器皿的氣體交換情況 如運(yùn)用棉塞、濾紙片或通氣好的封口膜封口。7在培育基中添加其它物質(zhì) 在培育基中參與間苯三酚或根皮苷或其它添加物，可有效地減輕或防治試管苗玻璃化，如添加馬鈴薯法可降低油菜的玻璃化苗的產(chǎn)生頻率，而用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壯素可減少重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發(fā)生；而添加1.5 g/L2.5g/L的聚乙稀醇成為防治蘋果砧木玻璃化的措施。在培育基中參與0.3%的活性炭還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃化有良好作用。第八節(jié) 試管苗的馴

53、化與移栽一、試管苗的特點(diǎn)1.試管苗的生態(tài)環(huán)境 組織培育中培育出來的苗通常稱試管苗或組培苗。由于試管苗長期生長在試管或三角瓶等培育器皿中，與外界環(huán)境隔離，構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。 與外界環(huán)境條件相比具有以下4大差別，即高溫、高濕、弱光和無菌。1高溫且恒溫 在植物試管苗整個(gè)生長過程中，通常均采用恒溫培育，即使某一階段稍有變動(dòng)，溫差也是極小的；并且在培育過程中，通常溫度控制在252，有的植物需將溫度控制得更高；而外界環(huán)境條件，溫度處于不斷變化之中，溫度的調(diào)理完全是由自然界太陽輻射的日輻射量決議的，溫差很大，而且普通不會(huì)到達(dá)252。2高濕 植物組織培育中試管或培育瓶內(nèi)的水分挪動(dòng)有2條途徑，一是試管苗吸收的水分，從葉面氣孔蒸騰；二是培育基向外蒸發(fā)，而后水汽凝結(jié)又進(jìn)入培育基。這種循環(huán)就是培育瓶內(nèi)的水分循環(huán)，其循環(huán)的結(jié)果呵斥培育瓶內(nèi)空氣的相對濕度接近于100，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培育瓶外的空氣濕度，所以試管苗的蒸騰量極小?？梢娕嘤績?nèi)的水分形狀直接影響著試管苗的生長和各種生理活性。3弱光 組織培育中的光強(qiáng)與太陽光相比普通很弱，故幼苗普通生長也較弱，經(jīng)受不了太陽光的直接照射。4無菌 不僅培育基無菌，而且試管苗也無菌。