第8章發(fā)酵過程控制

1、第8章發(fā)酵過程控制每種微生物對溫度的要求可用最適溫度、最高溫度、最低溫度來表征。在最適溫度下，微生物生長迅速；超過最高溫度微生物即受到抑制或死亡；在最低溫度范圍內微生物尚能生長，但生長速度非常緩慢，世代時間無限延長。在最低和最高溫度之間，微生物的生長速率隨溫度升高而增加，超過最適溫度后，隨溫度升高，生長速率下降，最后停止生長，引起死亡。 發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制微生物受高溫的傷害比低溫的傷害大，即超過最高溫度，微生物很快死亡；低于最低溫度，微生物代謝受到很大抑制，并不馬上死亡。這就是菌種保藏的原理。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制1、微生物對溫度的要求不同與它們的膜結構物理化學性質有密切關系根

2、據(jù)細胞膜的液體鑲嵌模型，細胞在正常生理條件下，膜中的脂質成分應保持液晶狀態(tài)，只有當細胞膜處于液晶狀態(tài)，才能維持細胞的正常生理功能，使細胞處于最佳生長狀態(tài)微生物的生長溫度與細胞膜的液晶溫度范圍相一致。二、微生物與溫度相關性的原理發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制什么是液晶狀態(tài)？液晶狀態(tài)是指某些有機物在發(fā)生固相到液相轉變時的過渡狀態(tài)稱為液晶態(tài)。由固態(tài)轉變?yōu)橐壕B(tài)的溫度稱為熔點，以T1表示；由液晶態(tài)轉變?yōu)橐簯B(tài)的溫度稱為清亮點，以T2表示。T1與T2之間的溫度稱為液晶溫度范圍。那么為什么不同微生物對溫度的要求不同呢？根據(jù)細胞膜脂質成分分析表明，不同最適溫度生長的微生物，其膜內磷脂組成有很大區(qū)別。嗜熱菌只含飽

3、和脂肪酸，而嗜冷菌含有較高的不飽和脂肪酸。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制2、蛋白質結構人們采用二種方案來研究酶在低溫條件下的結構完整性和催化功能：(1)通過自然或誘導突變，將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然結構進行對比；(2)對比同屬嗜熱、嗜溫及嗜冷菌的蛋白結構通過對嗜冷酶的蛋白質模型和x一射線衍射分析表明，嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強，酶結構的柔韌性增加，使酶在低溫下容易被底物誘導產(chǎn)生催化作用發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制 嗜冷菌具有在0合成蛋白質的能力。這是由于其核糖體、酶類以及細胞中的可溶性因子等對低溫的適應，蛋白質翻譯的錯誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質，一方面是由于

4、其核糖體對低溫的不適應，翻譯過程中不能形成有效的起始復合物，另一方面是由于低溫下細胞膜的破壞導致氨基酸等內容物的泄露。3、蛋白質合成發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制4、合成冷休克蛋白低溫微生物適應低溫的另一機制是合成冷休克蛋白將大腸桿菌從370C突然轉移到100C條件時細胞中會誘導合成一組冷休克蛋白，它們對低溫的生理適應過程中發(fā)揮著重要作用，檢測嗜冷酵母的冷休克反應，發(fā)現(xiàn)冷刺激后冷休克蛋白在很短時間內大量產(chǎn)生。耐冷菌由于生活在溫度波動的環(huán)境中，它們必須忍受溫度的快速降低，這與它們產(chǎn)生的冷休克蛋白是密切相關的。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制二、溫度的影響與控制（一）溫度對發(fā)酵的影響1、溫度影響反應速率

5、發(fā)酵過程的反應速率實際是酶反應速率，酶反應有一個最適溫度。從阿累尼烏斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 積分得 E=E活化能Kr速率常數(shù)發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制K與溫度有關E越大溫度變化對K的影響越大發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制溫度對菌的生長、產(chǎn)物合成的影響可能是不同的青 霉 素120C300C發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制2、溫度影響發(fā)酵方向四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當溫度低于300C時，這種菌合成金霉素能力較強；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達到350C時，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。溫度還影響基質溶解度，氧在發(fā)

6、酵液中的溶解度也影響菌對某些基質的分解吸收。因此對發(fā)酵過程中的溫度要嚴格控制。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制（二）最適溫度的選擇1、根據(jù)菌種及生長階段選擇微生物種類不同，所具有的酶系及其性質不同，所要求的溫度范圍也不同。如黑曲霉生長溫度為370C，谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長溫度為30320C，青霉菌生長溫度為300C。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制在發(fā)酵前期由于菌量少，發(fā)酵目的是要盡快達到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長迅速；在中期菌量已達到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因為在稍低溫度下氨基酸合成蛋白質和核酸的正常途徑

7、關閉得比較嚴密有利于產(chǎn)物合成。發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，延長發(fā)酵周期沒有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長階段280C，合成期260C后期再升溫；黑曲霉生長370C，產(chǎn)糖化酶32340C。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長30320C，產(chǎn)酸34370C。最適溫度選擇要根據(jù)菌種與發(fā)酵階段做試驗。根據(jù)生長階段選擇發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制例：林可霉素發(fā)酵的變溫培養(yǎng)問題的提出接種后10h左右已進入對數(shù)生長期，隨后是10h左右的加速生長期，在40h左右對數(shù)生長期基本完成，在50h左右轉入生產(chǎn)期主要問題：如何維持適度的菌體濃度和延長分泌期？適當降低培養(yǎng)溫度可以延緩

8、菌體的衰老和維持相當數(shù)量的有強生產(chǎn)能力的菌絲體存在根據(jù)生長階段選擇溫度發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制變溫培養(yǎng)的正交設計發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制結論：前60h按31控制，縮短了適應期使發(fā)酵提前轉入生產(chǎn)階段，同時菌絲體已有相當量的積累，為大量分泌抗生素提供了物質基礎60小時后將罐溫降至3O使與抗生素合成有關的酶的活性增強，抗生素分泌量有所增加，同時因分泌期的延長有利于進一步積累抗生素發(fā)酵進入后期罐溫再回升至31 使生產(chǎn)菌在生命的最后階段最大限度的合成和排出次級代謝產(chǎn)物。溫度變化及其控制2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件

9、差時可適當降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養(yǎng)基稀薄時，溫度也該低些。因為溫度高營養(yǎng)利用快，會使菌過早自溶。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制3、根據(jù)菌生長情況菌生長快，維持在較高溫度時間要短些；菌生長慢，維持較高溫度時間可長些。培養(yǎng)條件適宜，如營養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長?？偟膩碚f，溫度的選擇根據(jù)菌種生長階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。要通過反復實踐來定出最適溫度。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制三、發(fā)酵過程引起溫度變化的因素（一）發(fā)酵熱Q發(fā)酵發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過程溫度變化的原因。所謂發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。什么叫凈熱量呢？在發(fā)酵過程中產(chǎn)生菌分解基質產(chǎn)生

10、熱量，機械攪拌產(chǎn)生熱量，而罐壁散熱、水分蒸發(fā)、空氣排氣帶走熱量。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量。發(fā)酵熱引起發(fā)酵液的溫度上升。發(fā)酵熱大，溫度上升快，發(fā)酵熱小，溫度上升慢?，F(xiàn)在來分析發(fā)酵熱產(chǎn)生和散失的各因素。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制1、生物熱Q生物在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來，這散發(fā)出來的熱就叫生物熱。微生物進行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制生物熱與發(fā)酵類型有關微生物進行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比

11、厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多一摩爾葡萄糖徹底氧化成CO2和水好氧：產(chǎn)生287.2千焦耳熱量， 183千焦耳轉變?yōu)楦吣芑衔?104.2千焦以熱的形式釋放厭氧：產(chǎn)生22.6千焦耳熱量， 9.6千焦耳轉變?yōu)楦吣芑衔?13千焦以熱的形式釋放二個例子中轉化為高能化合物分別為63.7和42.6發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制 培養(yǎng)過程中生物熱的產(chǎn)生具有強烈的時間性。生物的大小與呼吸作用強弱有關在培養(yǎng)初期，菌體處于適應期，菌數(shù)少，呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。菌體在對數(shù)生長期時，菌體繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌體也較多，所以產(chǎn)生的熱量多，溫度上升快，必須注意控制溫度。培養(yǎng)后期，菌體已基本上停止繁殖，主要靠菌體內的酶系進行

12、代謝作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度變化不大，且逐漸減弱。如果培養(yǎng)前期溫度上升緩慢，說明菌體代謝緩慢，發(fā)酵不正常。如果發(fā)酵前期溫度上升劇烈，有可能染菌，此外培養(yǎng)基營養(yǎng)越豐富，生物熱也越大。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制2、攪拌熱Q攪拌在機械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機械攪拌帶動發(fā)酵液作機械運動，造成液體之間，液體與攪拌器等設備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關，可用下式計算： Q攪拌P8604186.8（焦耳/小時） P攪拌軸功率 4186.8機械能轉變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ斄侩姍C功率P= E額定電壓I額定電流cos功率因素，1千瓦時8604186.8焦耳發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制3、蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)

13、 通氣時，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計。4、輻射熱Q輻射發(fā)酵罐內溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過發(fā)酵熱的5。Q發(fā)酵Q生物Q攪拌Q蒸發(fā)Q輻射發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制（二）發(fā)酵熱的測定有二種發(fā)酵熱測定的方法。一種是用冷卻水進出口溫度差計算發(fā)酵熱。在工廠里，可以通過測量冷卻水進出口的水溫，再從水表上得知每小時冷卻水流量來計算發(fā)酵熱。Q發(fā)酵GCm(T出T進)Cm水的比熱G冷卻水流量另一種是根據(jù)罐溫上升速率來計算。先自控，

14、讓發(fā)酵液達到某一溫度，然后停止加熱或冷卻，使罐溫自然上升或下降，根據(jù)罐溫變化的速率計算出發(fā)酵熱。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制根據(jù)化合物的燃燒值估算發(fā)酵過程生物熱的近似值。因為熱效應決定于系統(tǒng)的初態(tài)和終態(tài)，而與變化途徑無關，反應的熱效應可以用燃燒值來計算，特別是有機化合物，燃燒熱可以直接測定。反應熱效應等于反應物的燃燒熱總和減去生成物的燃燒熱的總和。H（H）反應物（H）產(chǎn)物如谷氨酸發(fā)酵中主要物質的燃燒熱為：葡萄糖 159555.9KJ/Kg谷氨酸 15449.3KJ/Kg玉米漿 12309.2KJ/Kg菌體 20934KJ/Kg尿素 10634.5KJ/Kg發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制可根據(jù)實測

15、發(fā)酵過程中物質平衡計算生物熱。例如某味精廠50M3發(fā)酵罐發(fā)酵過程測定結果的主要物質變化如表：發(fā)酵時間（h）0661212181831糖3730.324.041.7谷氨酸 5.9 15.4 23.9尿素2.96.0菌體 4.8 6.0 1.2玉米漿2.43.00.6發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵1218小時的生物熱為：Q生物24159555.90.612309.2610634.51.22093415.415449.3191098.1KJ/M3191098.1631849.7每小時的生物熱為31849.7KJ/M3發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制四、利用溫度控制提高產(chǎn)量例1 利用熱沖擊處理技術提高發(fā)

16、酵甘油的產(chǎn)量背景：（1）酵母在比常規(guī)發(fā)酵溫度髙10200C的溫度下經(jīng)受一段時間刺激后，胞內海藻糖的含量顯著增加。（2）Lewis發(fā)現(xiàn)熱沖擊能提高細胞對鹽滲透壓的耐受力（3）Toshiro發(fā)現(xiàn)熱沖擊可使胞內3磷酸甘油脫氫酶的活力提高1525，并導致甘油產(chǎn)量提高發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制實驗：甘油發(fā)酵是在髙滲透壓環(huán)境中進行的，因此可望通過熱沖擊來提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量正交條件A 沖擊溫度（0C） 40，45，50 B 開始時機（h） 8，16，30 C 沖擊時間（分） 15，30，60結果發(fā)酵16小時，450C沖擊30分鐘最佳，發(fā)酵96小時后甘油濃度提高32.6，發(fā)酵罐實驗見圖（A）16h,450C

17、,30min（B）12h,450C,30min發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制A 溫度；B 開始時機；C 沖擊時間發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制A比B好發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制例2 重組大腸桿菌人Cu/Zn-SOD的高表達Lac啟動子，用乳糖作誘導劑 270C 300C 340C 370CSOD 4966 14270 6590 4638比活 810 1471 679 526蛋白 6.129 9.70 9.79 11.88OD600 7.41 10.72 11.78 24.77發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制原因：1、乳糖被用于合成菌體和其它蛋白，減少了合成SOD的原料，隨

18、著溫度升高，蛋白和菌濃都增加。2、高溫下可能SOD降解速率增加，雜蛋白增加3、低溫下由于比生長速率低，質粒脫落減少4、低溫下菌的衰老減緩，死亡率低發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制小 結微生物最適生長溫度微生物對溫度的要求不同與它們的膜結構有關微生物的生長溫度與細胞膜的液晶溫度范圍相一致微生物對溫度的要求與酶分子結構的區(qū)別有關，如蛋白構象穩(wěn)定性因素改變，活性位點關鍵區(qū)域氨基酸的取代，離子束縛作用(ion binding)減弱，蛋白核心區(qū)域疏水作用下降等發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制溫度對發(fā)酵的影響：溫度影響反應速率溫度影響發(fā)酵方向最適溫度的選擇根據(jù)菌種生長階段選擇根據(jù)培養(yǎng)條件選擇菌種的生長情況發(fā)酵工程控制