引物篇引物合成與各種問題總結(jié)_第1頁
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文檔簡介

1、WORD9/9引物篇1.引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn),無論采用什么機器合成,合成的原理都一樣,主要差別在于合成產(chǎn)率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶聯(lián)以與起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的,合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的,相鄰的核苷酸通過35磷酸二酯鍵連接。第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng),脫去其5-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5-羥基;第二

2、步,合成DNA的原料,亞磷酰胺保護核苷酸單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,它的3端被活化,5-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。第三步,帶帽(capping)反應(yīng),縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng),這種短片段可以在純化時分離掉。第四步,在氧化劑碘的作用下,亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。經(jīng)過以上四個步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5-羥基上的保護基團DMT,重復(fù)以上步驟,直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效

3、率。通過氨水高溫處理,連接在CPG上的引物被切下來,通過OPC, PAGE等手段純化引物,成品引物用C18濃縮,脫鹽,沉淀。沉淀后的引物用水懸浮,測定OD260定量,根據(jù)定單要求分裝。2.引物純化方式有哪些,如何選擇?C18柱脫鹽:有人稱其為簡易反相柱,它對DNA有特異性的吸附,可以被有機溶解洗脫,但不會被水洗脫,所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上,它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。OPC純化: OPC純化是根據(jù)DNA保護基(DMTr基)和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純

4、化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。PAGE純:PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,對DNA片段進行分離,然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法,純化后的DNA純度大于95%,對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。HPLC純化:HPLC純化是使用高效液相色譜的原理,對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高,批量生產(chǎn)效率不高。3.引物的OD數(shù)如何定量?答:引物合成引物OD數(shù)是這樣測定的:用紫外分光光度計,波長260nm,石英

5、比色杯,光程為1厘米,測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后,用1ml水稀釋測OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。4.需要什么級別的引物?答:引物常用的純化方式C18脫鹽,OPC純化,PAGE純化,HPLC純化。根據(jù)實驗需要,確定訂購引物的純度級別。應(yīng)用 引物長度要求 純度級別要求一般PCR擴增 45 base PAGE診斷PCR擴增 40base OPC, PAGEDNA測序 20base左右 OPC亞克隆,點突變等 根據(jù)實驗要求定 OPC, PAGE,HPLC基因構(gòu)建(全基因合成) 根據(jù)實驗要求定 PAGE反義核酸

6、 根據(jù)實驗要求定 PAGE修飾引物 根據(jù)實驗要求定 PAGE, HPLC5.最長可以合成多長的引物?答:引物越長,出現(xiàn)問題的概率就越大。我們合成過120base的引物,但是產(chǎn)率很低。除非需要,建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗產(chǎn)品,全長(還不一定正確)引物的百分比不會超過40%,后續(xù)處理還有丟失很多,最后的產(chǎn)量是很低。6.需要合成多少OD數(shù)?答:根據(jù)實驗?zāi)康拇_定。一般PCR擴增,2 OD引物,可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接,1 OD就足夠了。但是有些研究人員,就做幾次PCR,但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)

7、建的引物都比較長,但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長, 最后全長得率就越低,出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求,其實也是對社會資源的一種浪費,同時也從一個側(cè)面反映了部分研究人員,特別是新手的自信心不足,總覺得需要重復(fù)多次才能成功。7.如何檢測引物的純度?答:實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫

8、外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。如果條件許可,也可以用EB 染色或銀染方式染色。8.如何計算引物的濃度?答:引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核對合成報告單和引物標(biāo)簽上的引物OD數(shù)是否一致。如果不一致,請和我們聯(lián)系。我們可以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實際產(chǎn)量是多少。一般情況下,我們建議將引物的濃度配制成50pmol/ul,加水的體積(微升)按下列方式計算:V (微升)= OD數(shù)*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度,按上述公式換算。注意:1 O

9、D260= 33 ug/ml.9.如何計算引物的Tm值?答:引物設(shè)計軟件都可以給出Tm,引物長度,堿基組成,引物使用緩沖的離子強度有關(guān)。長度為25mer以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)對于更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC) 600/size公式中,Size = 引物長度。Tm的定義:Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary stran

10、d. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperat

11、ure. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物(含修飾)的分子量是如何確定的?答:非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5,引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量。或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod

12、) (Nx * Wx)+( Ni* Wi) +16* Ns 62.NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量,WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分別為修飾基團的數(shù)目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù),例如G+A混合的分子量為(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目,硫代每個位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量Base Molecular WeightA 313.21C 289.18G 329.21T 304.19I 314.2U 290.17常

13、規(guī)修飾基團分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.605-(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.495-HEX 744.13 3-(6 FAM) 569.465-TET 675.24 3-Amino Modifier C3 153.075-Cy5 533.63 3-Amino Modifier C7 209.185-Cy3 507.59 3-Thiol Modifier C3 154.1211.如何溶解引物?答:干燥后的引物質(zhì)地非常疏松,開蓋前最好離心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tr

14、is pH7.5緩沖液,室溫放置幾分鐘,振蕩助溶,離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩(wěn)定。12.如何保存引物?答:引物合成后,經(jīng)過一系列處理和純化步驟,旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前,室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復(fù)性要求較高,合成的OD數(shù)較大,建議分裝,避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。13.合成的引物5端是否有磷酸化答:合成的引物5為羥基,沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5端磷酸化,或者要求我們合成時直接在5或3端進行磷酸化,需要另外收費。14

15、.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題?連接反應(yīng)需要引物的5磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上,引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上,需要檢查載體的酶切效果,需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu),退火的難度較大,退火時需要提高退火溫度。15.測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事?答:測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變,特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大,但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心,引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的,堿基輸錯的機會不多。我們有一套控制辦法,預(yù)防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋,人們還沒有辦法徹

16、底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣,采用的機器也基本一樣,合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的,所有每個合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似,沒有人可以超脫。引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng),合成效率最高也就是99%,副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù),一般認(rèn)為,偶連過程中,正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去,故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變,一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的,Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物,在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變,產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是

17、堿基不能100%脫保護,即引物上可能含有殘留保護基團,引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對,當(dāng)擴增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,可能被細菌中修復(fù)系統(tǒng)補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 (脫嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A,測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解,測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。引物合成過程中,造成堿基插入,缺失,置換突變的因素客觀存在,有不少降低

18、發(fā)生的頻率建議和措施,但是這些措施還停留在實驗室階段,還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)?;a(chǎn)中。16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高?答:引物合成時,每一步反應(yīng)效率都不能達到100%,產(chǎn)生堿基插入,缺失,置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長,突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失,這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增,不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒有突變,引物合成也不可能保證100%正確。要知道,引物合成中發(fā)生錯誤(非人為因素)的頻率,比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成,長鏈引物合成,您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變

19、,該如何處理?答:對您遇到的困惑,我們表示同情。遇到這種情況,首先和我們?nèi)〉寐?lián)系,我們的生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄,主要是核對合成序列是否和定單一致,我們在電腦中保留所有原始數(shù)據(jù)。如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯,我們建議重新挑取克隆測序,您可能會找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗,40個堿基以下的引物,測1-2個克隆就可以了;40個以上的特別是用于全片段拼接合成的,就需要多測一些了。一般情況下,每個克隆突變的位點都不一樣,提示正確的總是有的,就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次,不過重合的引物和第一次的引物一樣,都可能含突變,不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?;蚱唇舆^程中,

20、如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多,就多測幾個,否則就重合一下引物。18.引物是經(jīng)過PAGE純化的,為什么還有堿基缺失或插入?答:理論上分析型PAGE變性電泳,可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳,上樣量都是非常大,電泳時的條帶非常寬,帶與帶之間有重疊,分辨率已下降,電泳后割帶回收目的引物時,很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國有一個不好的現(xiàn)象,PAGE純化的引物,特別是長引物要的量都比較高,導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。建議:您如果減少OD數(shù),引物遇到的問題可能就會少一些。19. TaqMan 探針設(shè)計的基本原則是什么?答:下列原則供您參考。TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物(擴

21、增產(chǎn)物50-150bp),但不能與引物重疊。長度一般為18-40mer 。G-C含量控制在40-80%左右。避免連續(xù)一樣堿基的出現(xiàn),特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。在引物的5端避免使用G。選用比較多的堿基C。退火溫度Tm控制在 68-70C左右。有用的熒光染料參數(shù)Name Name 吸收波長 發(fā)射波長 colors6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm GreenTET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm OrangeHEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm PinkTAM

22、RA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm RoseROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm RedCy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm RedCy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet20.Primer設(shè)計的基本原則是什么?答:引物設(shè)計的下列原則供您參考。引物長度一般在18-35mer。G-C含量控制在40-60%左右。避免近3端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。如果可能避免在3端最后5個堿基有2個以上的G或C。如果可能避免在3端最后1個堿基為A。避免

23、連續(xù)一樣堿基的出現(xiàn),特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。退火溫度Tm控制在 58-60C左右。如果是設(shè)計點突變引物,突變點應(yīng)盡可能在引物的中間。21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?答:我們多次接到類似的投訴:引物應(yīng)該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低,怎么會有蛋白質(zhì)污染?遇到這樣的投訴有時我們感到很是為難。投訴者有時心情很不好,還不聽解釋。撇開其他不談,引物化學(xué)合成,哪里有機會污染到蛋白質(zhì)?需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引

24、物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase Composition A260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.6622.同樣的OD用PAGE

25、檢測,EB染色為什么深淺不一?答:通??梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA),因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同,形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同,EB的染色程度也會有差異,比如Oligo(dT)等不形成二級結(jié)構(gòu),EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量,而用紫外分光光度計檢測。同樣道理,用EB染色來照片不適合所有引物。23.引物不純會有什么后果?答:引物不純可能會導(dǎo)致:1)非特異性擴增;2)無法用預(yù)先設(shè)計在引物5端酶切位點的酶切開,特別是沒有保護堿基的引物;3) 用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。24.為什么我們的引物

26、重合了幾遍都擴增不出來?答:有些PCR擴增沒有成功,懷疑是引物不好。PCR擴增不成功的因素很多,需要您耐心地分析,最好在實驗時設(shè)置對照來判定原因。如果您懷疑引物的問題,請您首先測定您溶解的引物的OD值,看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的,請您告訴我司您的引物編號,我們會復(fù)查留存樣品。如不明原因,我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增,請您查找其它原因。25.已經(jīng)溶解的引物,為什么原先使用正常,而過一段時間再使用就不好了?答:如果您溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶,會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合,液體不均勻也可能會造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物,避免反復(fù)凍溶。建議使

27、用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5), 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題,而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。26.引物質(zhì)量好壞的判斷標(biāo)準(zhǔn)是什么?答:合成的引物和您的定單序列一致,而不是能否擴增出您所需要的產(chǎn)物。27.PCR擴增不出就引物有問題嗎?答:基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴增技術(shù),各色各樣的高溫聚合酶,就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出,擴增效率低的問題。如槽式PCR就是擴增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴增, GC含量高的片段,非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。引物擴增

28、不出,主要是下列兩種情況比較常見(1) RT-PCR。請注意,很多基因通過常規(guī)RT PCR方法是很難不增出來的。 RT- PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細胞中含量。(2)從基因組中擴增。一般情況下,基因在基因組中都是單拷貝,基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量。基因組DNA過高,會影響反應(yīng)體系中的Mg和pH。28.PCR擴增有很強的非特異條帶,說明引物有污染嗎?答:不能。瞧,擴增目標(biāo)很弱或沒有,道是非特異性條帶很亮,說明引物不純或有污染。一些用戶如是說。我們曾分析過一些非特異條帶,測序發(fā)現(xiàn)在這些非特異性片段的兩頭至少可以發(fā)現(xiàn)一條引物序列。我們只能說非特異性擴增一般是

29、模板污染(如RNA中污染基因組)或擴增條件不合適所致。我最近合成了幾十對引物,在實戰(zhàn)中多多少少有些心得,拿出來給大家分享。我感覺想把引物合成的比較好,除了前引物和后引物的Tm不能相差太大,我們還要重點考慮以下因素:一、GC% GC含量對于PCR反應(yīng)來說GC含量在40%60%,一般50%左右比較合適;而對于測序引物和雜交探針來說GC含量至少應(yīng)為50%。產(chǎn)物中GC含量最好大于引物中的GC含量。二、Degeneracy 多義性當(dāng)設(shè)計多義引物時應(yīng)盡量減少引物多義性,這樣會帶來更好的特異性,應(yīng)盡量避免3末端的多義性,因為這里即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。三、3 End Stability 3 末端

30、穩(wěn)定性引物穩(wěn)定性影響它的錯配效率,一條理想的引物應(yīng)該有一個穩(wěn)定性較強的5 末端和相對穩(wěn)定性較弱的3 末端。如果引物3 穩(wěn)定性強,有可能在即使5 末端不配對的情況下造成錯配,形成非特異性擴增條帶(secondary bands) 。而3 末端穩(wěn)定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯配時,由于3 末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。四、GC Clamp GC鉗引物與目的位點的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5 末端。這一段有較強穩(wěn)定性的5 末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。五、Secondary Structures 二級結(jié)構(gòu)

31、二級結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計中必須考慮的一個重要因素。二級結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量,發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點的結(jié)合能力,從而降低擴增效率,形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴增中發(fā)揮作用。六、Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補堿基分子配對造成引物折疊形成的二級結(jié)構(gòu),并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子的反應(yīng),僅僅需要三個連續(xù)堿基配對就可以形成。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以與折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量,如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng),如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。七、Dimer 二聚體

32、引物之間的配對區(qū)域能形成引物二聚體,它是一樣或不同的兩條引物之間形成的二級結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴增并減少目的擴增產(chǎn)物,二聚體可以在序列一樣的兩條引物或正反向引物之間形成,如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴(yán)重,3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增。八、False Priming 錯配如果引物可以結(jié)合除目的位點外的其他區(qū)域,擴增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布(smear)。3 末端連續(xù)幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對,在使用引物設(shè)計軟件時,您可以分別設(shè)定確認(rèn)為錯配的3 末端或引物全長形成連續(xù)堿基配對的數(shù)量。順便說一下,如果是新手,剛開始接觸引物設(shè)計,推薦使

33、用Primer Premier 5.0,因為它界面簡單,易學(xué)易用;如果你想把引物設(shè)計得盡善盡美,公認(rèn)的首選軟件是Oligo,其次我認(rèn)為是DNAstar。Oligo功能強大,所以使用起來就沒有Primer Premier 5.0那么簡便。先用Primer Premier 5.0設(shè)計,然后把設(shè)計好的引物拿到Oligo里去檢測這對引物的優(yōu)劣,我想這對大多數(shù)引物設(shè)計者是一個不錯的選擇! 補充一:具體說一下引物中GC含量問題引物的GC含量一般為 40-60%,以45-55為宜,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述圍,這時應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以與Tm 值保持接近(上下游引物的GC含量不能相差太大),以有利于退火

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