分子克隆經(jīng)驗(yàn)(共8頁(yè))

1、做了快7年的分子克隆(k ln)，從加樣加不好，到現(xiàn)在輕松PCR，我想分子生物學(xué)這塊還是有很多經(jīng)驗(yàn)可以分享一下的?；蛟S很多人會(huì)說(shuō)分子克隆過(guò)程中出現(xiàn)(chxin)問(wèn)題最多的大概就是連接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在個(gè)步驟上很久。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的摸索我在連接這個(gè)問(wèn)題上有一些體會(huì)，我認(rèn)為連接的問(wèn)題多集中在連接的體系、DNA的用量、vector和insert的比例、連接酶等。但是我認(rèn)為，連接不成功，問(wèn)題并不一定出在連接這步上。有很多環(huán)節(jié)影響連接的成敗，如酶切的好不好、回收的質(zhì)量好壞、連接時(shí)的濃度或比例、感受態(tài)等。以下我詳細(xì)說(shuō)明。1，PCR引物的設(shè)計(jì)(shj)。通俗地說(shuō)，很多人用了很多軟件設(shè)計(jì)來(lái)設(shè)計(jì)去，又

2、是考慮發(fā)夾結(jié)構(gòu)，又是考慮二聚體，又是考慮Tm值，折騰來(lái)折騰去，但其實(shí)沒(méi)那么復(fù)雜。首先保證你要的基因是正確的，這個(gè)可以從NCBI中找到，大部分是沒(méi)問(wèn)題的，然后再找到起始密碼子，從那開(kāi)始大概上游取20-27bp，加上酶切位點(diǎn)，加上保護(hù)堿基（一般3個(gè)）就是上游引物，取后20-27bp堿基，反向互補(bǔ)，加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基組成下游引物。這樣引物設(shè)計(jì)就完成了，可以放到軟件里看看GC含量，Tm值，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體等，適當(dāng)調(diào)整堿基個(gè)數(shù)和保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)。需要額外注意的是移碼問(wèn)題。需要指出的是設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要考慮切點(diǎn)的甲基化問(wèn)題。做普通的克隆會(huì)涉及到甲基化形式有兩種：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大腸桿菌都

3、有這兩種甲基化酶。dam甲基化酶識(shí)別GATC位點(diǎn)并甲基化；dcm甲基化酶識(shí)別CCWGG位點(diǎn)（W是A或T）并甲基化。如果有這兩種位點(diǎn)那么多數(shù)情況內(nèi)切酶是切不開(kāi)了。容易受甲基化影響的內(nèi)切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加個(gè)G或后面加個(gè)C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加個(gè)GA或后面加個(gè)TC也是dam甲基化，等等有好多。這些容易甲基化的切點(diǎn)設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要注意，避免引入甲基化位點(diǎn)。如果真是避免不了或者后來(lái)才發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，那么把甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到甲基化酶缺陷型大腸桿菌中再提質(zhì)粒就沒(méi)有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invi

4、trogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。2，PCR產(chǎn)物。兩種方式：一種純化后直接酶切連接；一種連T載體再往下切連接。我個(gè)人強(qiáng)烈建議第二種，連T載體。因?yàn)镻CR產(chǎn)物直接酶切我覺(jué)得有兩個(gè)缺點(diǎn)：由于兩頭把手太短，雖說(shuō)有保護(hù)堿基，但我覺(jué)得還是不如從質(zhì)粒上往下切好切，而且容易切壞、切碎；無(wú)法從電泳上看出來(lái)切沒(méi)切開(kāi)，因?yàn)橐簿颓邢铝藥讉€(gè)十幾個(gè)bp，帶形沒(méi)啥變化。連T載體的優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)載體后，大提一次的質(zhì)?？鋸堻c(diǎn)說(shuō)夠用一輩子的，不用總PCR往出調(diào)了，再說(shuō)PCR那東西還不太穩(wěn)定，一把多一把少的。酶切會(huì)很清晰，切下來(lái)了就是有帶，沒(méi)切動(dòng)就是沒(méi)有，沒(méi)連上也能知道不是沒(méi)切開(kāi)而是別的步驟有問(wèn)題。連

5、T載體也有些麻煩的地方，如需要的切點(diǎn)有時(shí)跟T載體上自帶的切點(diǎn)沖突，這就要小心鑒別；而且連T載體最好測(cè)序看一下PCR的產(chǎn)物對(duì)不對(duì)、切點(diǎn)對(duì)不對(duì)?？傮w來(lái)講連T載體是很有優(yōu)勢(shì)的。3，提質(zhì)粒有時(shí)手工小提或粗提的質(zhì)粒酶切效果不好，這可能是提取的不夠純或者內(nèi)切酶品質(zhì)不好。所以若酶切效果不佳建議用柱子精提或大提。4，酶切用于連接的酶切很關(guān)鍵。需注意如下幾點(diǎn)：如果是雙酶切A和B，預(yù)實(shí)驗(yàn)中必須做A和B各自的單酶切和A+B的雙酶切,好確認(rèn)這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點(diǎn)都好用。如果切不開(kāi)就要考慮是不是酶的問(wèn)題，buffer的問(wèn)題，質(zhì)粒上有沒(méi)有這些切點(diǎn)，序列是否甲基化等。酶切盡量用大體系，如50ul、100ul等。大體系

6、能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對(duì)反應(yīng)有利。相反，連接盡量用小體系，以增加DNA末端的碰撞機(jī)會(huì)。如果要回收、連接，酶切用的DNA量我的經(jīng)驗(yàn)是不用太大。大了會(huì)切碎，形成一些不規(guī)則的末端，不利于連接。酶切后的電泳，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒(méi)有彌散，沒(méi)有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團(tuán)亮等情況就是切的不好，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功率會(huì)降低。若真是效果很差建議改進(jìn)體系重新切。5，回收回收可以用柱式試劑盒或手工法。柱式回收試劑盒：此類(lèi)試劑盒適合各種長(zhǎng)度DNA，對(duì)黏性末端基本沒(méi)有破壞，回收效率也不錯(cuò)。手工醇沉法步驟如下，把切得的膠弄碎，用Tris-HCl浸泡一

7、段時(shí)間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉淀用70乙醇漂洗，再用Tris溶解。次方法優(yōu)點(diǎn)是對(duì)DNA和黏性末端的損傷最小，缺點(diǎn)是容易損失DNA。若本來(lái)DNA數(shù)量就不多，用手工法很容易丟失殆盡；如果DNA量很大可以考慮使用?；厥蘸笠娪?，一來(lái)估算回收液濃度，二來(lái)看回收DNA的質(zhì)量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質(zhì)量不好。因?yàn)闂l帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長(zhǎng)度的片段，而主帶雖然還在那個(gè)位置但也已遭到一定程度的破壞。質(zhì)量不好的回收產(chǎn)物做連接成功率會(huì)降低，假陽(yáng)性克隆會(huì)增加。造成回收質(zhì)量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出現(xiàn)

8、酶切所描述的情況，就容易造成回收質(zhì)量不好。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。6，感受態(tài)做連接要求感受態(tài)的效率要高。感受態(tài)的感受效率一般剛制備完時(shí)是最高的，以后逐漸減弱，而且每次開(kāi)80冰箱溫度微升對(duì)感受態(tài)效率都有一定影響，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態(tài)時(shí)動(dòng)作迅速、最大程度減少感受態(tài)盒升溫。都知道感受態(tài)效率高好，但麻煩的是感受態(tài)效率的高低不好通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)，因?yàn)槿敉ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)質(zhì)粒來(lái)檢測(cè)，只要是效率中等的感受態(tài)都能長(zhǎng)出很多克隆。所以如果你們的感受態(tài)已經(jīng)儲(chǔ)存了很長(zhǎng)時(shí)間或者連接長(zhǎng)的克隆連續(xù)幾把都太少就要重做感受態(tài)了。制備感受態(tài)不推薦新手直接去做，最好由經(jīng)驗(yàn)豐富者做或他帶你做。用新做的感受態(tài)

9、轉(zhuǎn)質(zhì)粒，用同樣手法用量，你會(huì)發(fā)現(xiàn)比舊感受態(tài)明顯多長(zhǎng)很多克隆。7，連接最后才輪到連接。連接的問(wèn)題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產(chǎn)物質(zhì)量好，連接不會(huì)很難。DNA的量：DNA總量有幾十ng就能連接成。當(dāng)然如果你的DNA質(zhì)量好，DNA用量越大連接效率越高。就怕你為了追求DNA數(shù)量而降低了質(zhì)量，那可就得不償失了。vector和insert的比例：如果insert不長(zhǎng)（2kb以下）、vector是insert的幾倍長(zhǎng)，可以用1：31：9。如果insert較長(zhǎng)（3、4kb以上）、vector和insert長(zhǎng)度相似或insert比vector還長(zhǎng)，可以用1：11：3。短片段的連接相對(duì)容易，做的好可以挑

10、到好多正確的克隆。長(zhǎng)片段的連接效率較低，陽(yáng)性克隆率小于等于10是很正常的。我做過(guò)一個(gè)長(zhǎng)片斷的連接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20個(gè)克隆有一個(gè)對(duì)。體系體積：通常用20ul都能連上，若連長(zhǎng)片段可以壓縮成10ul（前提是DNA數(shù)量不變）。我覺(jué)得體系不是很關(guān)鍵，有位很精通克隆的老師說(shuō)他都用50ul體系，照樣百發(fā)百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，體系中不加水也行。前述我自己連的長(zhǎng)片段也是用20ul體系，vector和insert各上8ul。T4連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢(qián)一分貨，而且連接酶控制著整個(gè)分子克隆過(guò)程的瓶頸連接，強(qiáng)烈建議買(mǎi)好的。我用

11、過(guò)Promega的，還好；BBI的湊合用。如果連長(zhǎng)片段就加二倍的連接酶。連接時(shí)間：過(guò)夜。過(guò)夜就應(yīng)該足夠了，但是你要是不急著轉(zhuǎn)化放到4度放幾天也行，我個(gè)人認(rèn)為時(shí)間長(zhǎng)只好不壞。連接溫度：最適是16。有人用PCR儀造16，我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺(jué)差不多十四五六度，然后蓋蓋過(guò)夜，基本上溫度不太變。你若感覺(jué)好不溫度，拿個(gè)溫度計(jì)測(cè)也行。有人用4度連接，也行，我有時(shí)先16度過(guò)夜，再放4度里幾天。轉(zhuǎn)化：連接的轉(zhuǎn)化不能像轉(zhuǎn)質(zhì)粒那么隨便，要小心翼翼，盡量作到不放棄任何一個(gè)菌。一般所用的感受態(tài)體積最少是連接體系的5倍。長(zhǎng)片段的連接轉(zhuǎn)化時(shí)搖菌2小時(shí)。對(duì)照：對(duì)照很關(guān)鍵，可以反應(yīng)出很多重要的信息，不要懶，你的連

12、接若是問(wèn)題不少，就要乖乖的做對(duì)照。一般有如下幾種對(duì)照方式：轉(zhuǎn)化質(zhì)粒對(duì)照。和連接產(chǎn)物同樣抗性、一起轉(zhuǎn)化、涂在同一個(gè)板上。這個(gè)對(duì)照目的是檢測(cè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉(zhuǎn)化的手法是否正確、以及感受態(tài)的效率如何（這需要你每次轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都用相同的手法、用量，看長(zhǎng)的菌落數(shù)，若明顯太少就要懷疑感受態(tài)）。還有一個(gè)作用，如果質(zhì)粒早就長(zhǎng)出來(lái)了，都長(zhǎng)挺大了你的連接產(chǎn)物還沒(méi)動(dòng)靜呢，那八成是沒(méi)戲了，別等了趕快去準(zhǔn)備下次連接的材料吧。切完回收的vector直接轉(zhuǎn)化對(duì)照。如果你是雙酶切，切完的vector和沒(méi)切的vector的長(zhǎng)度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開(kāi)，就要做這個(gè)對(duì)照。目的是看切的是否徹底，

13、是否還有環(huán)狀質(zhì)粒存在。長(zhǎng)不出克隆是對(duì)的，若長(zhǎng)出克隆，好好改進(jìn)你的酶切系統(tǒng)吧。切完回收的vector加連接酶自身連接再轉(zhuǎn)化做對(duì)照。雙酶切的，最好要做這個(gè)對(duì)照，而且這個(gè)對(duì)照長(zhǎng)的克隆要挑若干提質(zhì)粒。一、若切完的目的vector和沒(méi)切的vector的長(zhǎng)度相差較大，電泳條帶離的遠(yuǎn)，這個(gè)對(duì)照能檢測(cè)酶切和回收的質(zhì)量。如果DNA末端遭破壞或斷裂，會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生各種末端，這些末端少數(shù)能連接到一起，長(zhǎng)度上小于等于回收的vector。二、若切完的vector和沒(méi)切的vector的長(zhǎng)度相差不大，這個(gè)對(duì)照除了檢測(cè)“一”中所說(shuō)的還檢測(cè)是否有只進(jìn)行了單酶切的?？傊婚L(zhǎng)克隆或只長(zhǎng)很少是對(duì)的，長(zhǎng)多了還是去改進(jìn)上游的步驟吧。如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率會(huì)較高，但也不能保證一次成功。在確保各步驟產(chǎn)物質(zhì)量都不錯(cuò)的前提下若重復(fù)3、5次還沒(méi)連上就要回頭仔細(xì)檢查這個(gè)克隆的策略有沒(méi)有問(wèn)題了，要是策略