腫瘤基因有效治療根本策略和常用方式

1、腫瘤基因有效治療根本策略和常用方式一.腫瘤和基因治療的基本概念1.腫瘤（Tumor） 機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。 2.基因治療 指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。 3.什么是腫瘤基因治療 基因治療的經(jīng)典概念指通過外源基因?qū)巳梭w以糾正內(nèi)在的基因缺陷

2、的療法。腫瘤基因治療不再局限于“糾正基因缺陷”，系指將外源的正常基因?qū)巳梭w，達(dá)到直接或間接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的目的?；蚴巧荆巧锏靡员３制溥B續(xù)性和穩(wěn)定性的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究的不斷深人，出于對腫瘤是一種基因病的認(rèn)識，加之惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率較高，這使得惡性腫瘤的基因治療成為近年來基因治療研究的主要內(nèi)容和熱點(diǎn)。 4.與基因治療有關(guān)幾個概念 a.基因毒癌發(fā)生發(fā)展的第一步是活化致癌物，改變細(xì)胞內(nèi)的DNA，導(dǎo)致原癌基因的移位及擴(kuò)增，這些特殊基因的翻譯，使帶有這些異常基因細(xì)胞的某些特性得以專一表達(dá)，一個特殊的化學(xué)物對一系列細(xì)胞有誘變及DNA修復(fù)作用者，稱為基因毒。

3、目前人類已知的致癌物均為基因毒。 b.原癌基因(前癌基因)細(xì)胞癌基因存在于細(xì)胞基因組內(nèi)，激活前的細(xì)胞癌基因稱為原癌基因(前癌基因)，一旦原癌基因激活成癌基因便會引起細(xì)胞癌變，癌基因激活后，通過其表達(dá)產(chǎn)物改變細(xì)胞生長和分化規(guī)律，誘發(fā)細(xì)胞癌變。細(xì)胞癌基因被激活的途徑很多，如啟動子插人，基因重排和擴(kuò)增，基因點(diǎn)突變和DNA分子中去甲基化等。 c.抑癌基因正常細(xì)胞中存在抑制腫瘤發(fā)生的基因，稱為抑癌基因。抑癌基因的存在從最初的一個發(fā)現(xiàn)中得到證實(shí)，即一個腫瘤細(xì)胞和一個正常細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞，往往不具有細(xì)胞表型，即使兩種不同的腫瘤細(xì)胞雜交，也可能是非腫瘤性的，只有正常的親代失去某些基因之后，其子代才會發(fā)生腫

4、瘤。后來，通過限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)分析及分子克隆技術(shù)的研究證實(shí)，正常細(xì)胞中有一類對細(xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的基因，如大腸癌中的p53基因，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和骨肉瘤中的Rb基因。這兩種基因也是目前被確認(rèn)并研究最為深人的抑癌基因。如將正常的Rb基因轉(zhuǎn)人骨肉瘤細(xì)胞，Rb基因表達(dá)增高，細(xì)胞分裂幾乎完全抑制，將Rb基因轉(zhuǎn)人前列腺細(xì)胞，對正常細(xì)胞的生長無影響，但抑制了細(xì)胞的癌變，所 以當(dāng)這一類的抑癌基因發(fā)生丟失，失活或變異時，就會促進(jìn)細(xì)胞惡變。 二.采用基因治療腫瘤的基本策略目前國內(nèi)外惡性腫瘤基因治療基本策略包括： 1.免疫性基因治療 2.病因性基因治療 3.溶瘤腺病毒基因治療 4.自殺基因治療等1.免疫

5、性基因治療a. 免疫性基因治療的對象 : 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)發(fā)育未完善（3-4歲）和免疫機(jī)能衰退（老年人的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均衰退）而出現(xiàn)兩個腫瘤發(fā)生的年齡高峰期。 胸腺發(fā)育不良（Digeoges）綜合癥或咽囊綜合癥是因胸腺發(fā)育不良而導(dǎo)致細(xì)胞免疫系統(tǒng)停留在未分化階段，這類患兒兼有細(xì)胞免疫缺陷和體液免疫缺陷的共濟(jì)失調(diào)，惡性腫瘤的發(fā)生率高達(dá)10%。 由此說明細(xì)胞免疫和體液免疫功能的正?；蚧钚栽鰪?qiáng)在抗惡性腫瘤的發(fā)生中是不可缺少的。 選擇性IgA缺乏：患者血漿中IgA極低，而IgG、IgM與細(xì)胞免疫正常，組織中缺乏分泌IgA的漿細(xì)胞，約10%發(fā)生胃癌。當(dāng)IgM缺乏時，約有8%患者發(fā)生惡

6、性腫瘤以及淋巴網(wǎng)狀惡性疾病。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者免疫球蛋白很低，抗體產(chǎn)生受到嚴(yán)重影響時，臨床上病人除了反復(fù)發(fā)生化膿性感染外，其患者發(fā)生惡性腫瘤率為8-10%，常見類型為淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)腫瘤（56%）和胃腸道上皮癌（26%）。Wiskott-Aldrich綜合癥：（嚴(yán)重混合型免疫缺陷綜合癥）以血小板減少出血，反復(fù)感染為臨床特征，早期細(xì)胞免疫完善，隨之淋巴細(xì)胞減少，體外淋轉(zhuǎn)反應(yīng)缺乏，病兒很少活過青春期，約8-10%發(fā)生淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)腫瘤。 1.2 免疫性基因治療的方法 研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在著機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細(xì)胞本身的免疫性不強(qiáng)（如MHC表達(dá)不足），也可源

7、于抗原遞全細(xì)胞（APC）不能提供足夠的共刺激信號（如B7）或者機(jī)體免疫因子分泌不足，在免疫性基因治療中通過以下三種方法糾正機(jī)體免疫的耐受狀態(tài)。 a. 將某些細(xì)胞因子（如IL-2、TNF-a等）的基因轉(zhuǎn)染到機(jī)體免疫細(xì)胞（如TIL、LAK細(xì)胞及細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞）中，大幅度提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和反應(yīng)能力。 使用細(xì)胞因子的基因治療在一定程度上克服了細(xì)胞因子注射療法需反復(fù)多次應(yīng)用，副作用嚴(yán)重等缺點(diǎn)，療效有較大幅度提高。可以這樣認(rèn)為：腫瘤免疫細(xì)胞因子基因治療的開展，為惡性腫瘤患者帶來生的希望，其療效的穩(wěn)定，治療的簡單、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法而獨(dú)樹一幟，前景是令業(yè)內(nèi)人士振奮的

8、。 b. 腫瘤細(xì)胞存在功能性MHCI類抗原和共刺激信號表達(dá)不足，將一些與免疫識別有關(guān)的基因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)照射后再植入腫瘤患者體內(nèi);或者表達(dá)HLA-B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)復(fù)合物直接注射到瘤體內(nèi)，以大幅度增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫原性，誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)而提高宿主的免疫監(jiān)視功能和對腫瘤細(xì)胞的攻擊能力，達(dá)到治愈率的提高具有積極作用。c. 制備腫瘤KNA疫苗 采用編碼特異抗原的基因直接注入人體，通過其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)從而激發(fā)機(jī)體對編碼抗原的免疫反應(yīng)。應(yīng)用癌胚抗原（CEA）制備的DNA疫苗在實(shí)驗(yàn)中顯示出一定效果，研究的前景可觀，進(jìn)入臨床藥理實(shí)驗(yàn)只是時間問題

9、而毋庸置疑 。2 惡性腫瘤的病因性基因治療 腫瘤病因性基因治療主要針對癌基因和抑癌基因，其治療策略是抑制、阻斷癌基因的表達(dá)或替代，恢復(fù)抑癌基因的功能。從而達(dá)到治療腫瘤的目的。 a. 針對癌基因治療采用反義寡核苷酸、核酸、三鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸（Triplex-forming oligonucleotides，TFO）抑制腫瘤細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄，抑制癌基因的表達(dá)將有可能使腫瘤的基因表達(dá)調(diào)控回復(fù)到正常并使細(xì)胞重新分化或者誘發(fā)其凋亡（Apoptosis）。由于轉(zhuǎn)條是遺傳信息放大的過程，因此對癌基因的表達(dá)抑制來說更為有效，其治療前景是極為樂觀的。 b. 針對抑癌基因治療替代或恢復(fù)由于缺失或突變而丟失的抑癌基因（

10、Tumor suppressor gene）的正常功能是腫瘤病因性治療的手段而被世人所公認(rèn)。利用抑癌基因治療腫瘤，在體外的實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)治療學(xué)中取得較好的療效；但在體內(nèi)由于腫瘤體積較大；內(nèi)環(huán)境又十分復(fù)雜，基因轉(zhuǎn)移率限制等因素的干擾，抑癌基因治療的確切療效不盡人意值得進(jìn)一步研究。 3 溶瘤腺病毒基因治療 a. 溶瘤腺病毒的特點(diǎn)：具有復(fù)制性，因此所需病毒顆粒較小；能擴(kuò)展至鄰邁腫瘤細(xì)胞，作用范圍廣泛；溶瘤腺病毒可產(chǎn)生溶瘤和抗腫瘤免疫反應(yīng)；溶瘤腺病毒由于能夠復(fù)制故存在著不安全因素（轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、活化）對腫瘤患者造成損害而失去可控性應(yīng)引起注意和警惕。 b. 溶瘤腺病毒的主要分類：利用腫瘤特異表達(dá)的調(diào)控序例的表

11、達(dá)：黑色素瘤表達(dá)酪氨酸酶，肝細(xì)胞癌表達(dá)甲胎蛋白（AFP），結(jié)直腸癌表達(dá)癌胚抗原（CEF）從而控制病毒復(fù)制。利用腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，如腺病毒復(fù)制時抵抗宿主細(xì)胞凋亡可能相關(guān)的EIB55K蛋白發(fā)生變異或缺失時，病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞就會發(fā)生凋亡，從而使復(fù)制不能完成。代表為E1B55K剔除的d11520（onyx-015）腺病毒，它能夠在抑癌基因P53缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，從而達(dá)到裂鮮腫瘤細(xì)胞，同時又不損傷正常細(xì)胞的目的其特異的選擇性十分明顯。值得期待的是D11520和TH101病毒已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。這時于癌癥的預(yù)防的作用將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 4 自殺基因治療 一些來自病毒或細(xì)菌的基因具有一些特殊的功

12、能，其表達(dá)產(chǎn)物可將原先對哺乳動物細(xì)胞無毒的或毒性極低的前藥（Prodrug）轉(zhuǎn)換成毒性產(chǎn)物，導(dǎo)致這些細(xì)胞的凋亡。這類基因即稱為“自殺基因”（Suicide gene）由于自殺基因表達(dá)的產(chǎn)物多是能夠?qū)⑶八幋x為毒性產(chǎn)物的酶，故又稱為“前藥轉(zhuǎn)換酶基因”或“藥物敏感基因”。根據(jù)細(xì)胞自殺機(jī)制，將自殺基因作為治療性目的基因應(yīng)用于腫瘤治療的研究稱為腫瘤的自殺基因方式。在臨床實(shí)踐中設(shè)計腫瘤細(xì)胞特異性自殺機(jī)制的基因治療方案對腫瘤治療具有重大的實(shí)際應(yīng)用價值。 a. 自殺基因療法中酶和前藥 b. 自殺基因的特異性控制 要高效及特異性表達(dá)腫瘤自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的作用，自殺基因必須局現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞以選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。

13、一是利用免疫脂質(zhì)體，受體介導(dǎo)法進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移或直接瘤內(nèi)注射。二是利用腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)HSV-TK基因（I型單純皰疹病毒胸腺激酶）選擇性治療腦腫瘤。三是利用腫瘤特異表達(dá)的調(diào)控序例，如酪氨酸酶、甲胳蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA），在自殺基因的上游安插特異的轉(zhuǎn)條調(diào)節(jié)序例，可以實(shí)現(xiàn)自殺基因的特異表達(dá)，從而克服傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物作選擇性問題和較為嚴(yán)重的細(xì)胞毒問題，使腫瘤治療有較大幅度的進(jìn)展。 c.旁觀者效應(yīng)（Bystander effect） 用外源性自殺基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，未能轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞可因鄰近的少數(shù)腫瘤細(xì)胞攜帶有自殺基因而被前體藥物殺傷。研究發(fā)現(xiàn)，旁觀者效應(yīng)產(chǎn)生與自殺基

14、因的種類、腫瘤細(xì)胞的類型及數(shù)量有關(guān)。TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)是比較明顯和突出的。三.常采用的基因治療方法a.基因修飾腫瘤細(xì)胞“疫苗”療法 將某些細(xì)胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-、INF-、GM-CSF等轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，可使腫瘤細(xì)胞表達(dá)活性細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞基體內(nèi)致瘤性喪失，耐動物預(yù)接腫這種轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞后，該動物對再接種的同種腫瘤有抵抗作用。能分泌細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞具有腫瘤疫苗作用，成為新型的腫瘤“疫苗”。這種腫瘤疫苗的作用機(jī)制是由于細(xì)胞因子表達(dá)后，一方面促進(jìn)腫瘤表達(dá)特異抗原并誘發(fā)宿 主抗腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng);另一方面分泌的細(xì)胞因子增強(qiáng)CTL和

15、其他抗癌效應(yīng)細(xì)胞的作用。 b. 基因修飾TIL的過繼免疫療法 將細(xì)胞因子導(dǎo)入TIL細(xì)胞中，活化后的TIL具有顯著抗自身腫瘤的作用，回輸體仙后有聚集于腫瘤部位的傾向，攜帶的抗癌免疫增強(qiáng)性細(xì)胞因子基因在腫瘤局部表達(dá)量增加，同時還避免全身大劑量投用IL-2、TNF-等細(xì)胞因子所引起的嚴(yán)重毒副反應(yīng)。目前已將TNF-基因?qū)隩IL，并在癌癥患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)。 c. 免疫增強(qiáng)基因療法 是將MHC1類抗原基因經(jīng)體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，增加其免疫原性，有效地激活機(jī)體抗癌免疫反應(yīng)，降低腫瘤細(xì)胞的致瘤性。 d. 原位修飾腫瘤免疫原性的基因療法 直接在體內(nèi)原位修飾腫瘤免疫原性，誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒反應(yīng)，同時腫瘤組織的

16、CTL可產(chǎn)生一種“旁觀者效應(yīng)”(bystander effect),即CTL不僅可以殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)基因陽性腫瘤細(xì)胞，還可以殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)基因陰性腫瘤細(xì)胞，使受基因治療的瘤灶消退時，其他未治療的瘤灶也會消退。 e. 癌基因拮抗療法 腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)，可以通地阻斷癌基因的表達(dá)或恢復(fù)抑癌基因的功能來抑制腫瘤的發(fā)展或恢復(fù)其正常表型。 四.對未來腫瘤基因治療的展望 目前，在基因?qū)胼d體方面出現(xiàn)了兩 大主流：一是非病毒載體系統(tǒng)；二是病毒載體系統(tǒng)。 a. 非病毒載體主要包括改性的天然高分子和合成高分子兩大類。由于非病毒系統(tǒng)導(dǎo)入基因的效率相對較差，故在基因治療臨床試驗(yàn)中的使用率不到20%；但非病毒載體的生物安全性較好，特別是靶向性的脂質(zhì)體、靶向性 的多聚物，以及脂質(zhì)體/ 多聚物/DNA 復(fù)合物等新產(chǎn)品的出現(xiàn)，結(jié)合電脈沖、超聲等新技術(shù)，明顯提高了導(dǎo)入效率和靶向性，是今后非病毒載體發(fā)展的重要方向。 病毒載體在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，大約70%