代謝綜合征(共6頁)

1、一、代謝組學在中藥(zhngyo)研發(fā)中的應用上個世紀90年代末期, 代謝(dixi)組學(metabonomics)逐漸興起, 由于代謝物的復雜性, 很難用一種手段將所有代謝物一次檢測清楚, 因此部分學者根據代謝物的特異性對其進行分類研究, 從而形成了一系列分支研究, 如脂質組學及毒素組學等, 作為最重要的代謝組學分支, 脂質組學是研究的焦點。為保證中藥產品安全、有效、穩(wěn)定、可控，代謝組學在中藥研發(fā)中有以下應用。1 中藥(zhngyo)質量研究 道地藥材判別2 中藥藥效研究中藥作用機制研究發(fā)現新的生物活性物質3 中藥安全性研究中藥配伍減毒機理研究中藥安全性評價研究二、脂質組學在醫(yī)藥研究中的應

2、用類脂分子有以下重要作用：1 通過形成脂雙層使細胞具有完整性和獨立性2 為膜蛋白功能的實現和相互作用提供合適的疏水環(huán)境3 通過多種酶的作用，參與信號轉導脂質不僅是生物膜的骨架成分和能量貯存物質, 越來越多的證據表明, 脂質也參與細胞的許多重要功能。Han等于2003年正式提出了脂質組學(lipidomics)的概念從系統(tǒng)水平上研究生物體內的脂質, 揭示其相互作用及與其他生物分子的作用, 從而興起了研究脂代謝調控在各種生命現象中作用機制的新學科。近年來脂質組學引起了世界范圍關注, 被廣泛應用于生命科學, 尤其是醫(yī)藥研究等領域中。脂質組學是對整體脂質進行系統(tǒng)分析的一門新興學科, 通過比較不同生理狀

3、態(tài)下脂代謝網絡的變化, 進而識別代謝調控中關鍵的脂生物標志物, 最終揭示脂質在各種生命活動中的作用機制。電噴霧電離-質譜技術是脂質組學領域中最核心的研究手段, 目前已能對各種脂質尤其是磷脂進行高分辨率、高靈敏度、高通量的分析。隨著質譜技術的進步, 脂質組學在疾病脂生物標志物的識別、疾病診斷、藥物靶點及先導化合物的發(fā)現和藥物作用機制的研究等方面已展現出廣泛的應用前景。三、脂質組學優(yōu)勢(yush)探討中藥是多成分的復雜體系，人體是更復雜的生命系統(tǒng)，這就決定了中藥的藥效和作用機制具有復雜的非線性特征，表現出多成分、多層次、多靶點、多代謝途徑的特點。因此，采用經典的藥理學方法去研究中藥的作用機制，存在

4、著一定的理論差距和現實(xinsh)的技術瓶頸。中藥成功的治療疾病必須使代謝網絡中的缺陷部分正?；?，同時不得干擾其他維持健康所必須的代謝途徑調控。脂質組學研究脂質指紋圖譜，不僅研究藥物本身的代謝變化，而主要是研究藥物引起的內源性脂質的變化，更直接反映體內生物化學過程和狀態(tài)的變化。通過認識脂質指紋圖譜變化的原因，闡明藥物作用靶點或受體。結合(jih)這篇文章來說明脂質組學在中藥研究中的應用。背景：目前對代謝綜合征中脂質復雜變化的結果和原因只有部分被理解。幾個相互關聯的過程不斷惡化，這意味著多靶向通路可能比基于有限數量的替代標記策略更有效。中藥制劑系統(tǒng)流傳下來的類似代謝綜合征臨床特點的記錄可能有助

5、于開發(fā)代謝綜合征新的干預機制?？捎孟到y(tǒng)生物學和特定的動物模型的研究來進行評估。本文報告了由sub885c干預APOE * 3leiden.CETP小鼠血漿和肝臟脂質沉積的結果。sub885c根據中藥治療代謝綜合征的原則制備。1型大麻素受體拮抗劑利莫那班是一個控制體重和代謝反應的通用藥物。方法/主要調查結果：APOE * 3leiden.cetp輕度高膽固醇血癥小鼠隨機分為sub885c，利莫那班和不給藥的對照組。sub885c對體重沒有影響，但顯著降低血漿膽固醇（249%，P0.001），CETP水平（231%，P0.001），CETP活性（274%，P0.001）和增加高密度脂蛋白膽固醇含量

6、（39%，P0.05）。sub885c對脂類組學中的類膽固醇酯和甘油三酯影響最大。利莫那班能減少體重（29%，P0.05），但對血脂只有一個溫和的改善。在體外，sub885c提取物對3T3-L1細胞中的脂肪水解產生刺激作用，對脂肪生成產生抑制作用。結論：sub885c是一個多組分制劑，能對APOE * 3leiden.cetp小鼠產生與已知療效的藥物化合物（如利莫那班，阿托伐他汀，煙酸）相似的血脂抗動脈粥樣硬化變化，本研究成功地說明脂質組學對病癥干預效果產生的作用，可以幫助尋找治療與生活方式相關的代謝異常的新的目標或成分。代謝綜合征：代謝(dixi)綜合征(metabolic syndrome

7、,MS)是一組代謝紊亂性疾病的總稱,是以中心性肥胖、胰島素抵抗、高血壓、高三酰甘油血癥、低高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)、糖耐量下降或型糖尿病為主要臨床表現的一個癥候群。MS患者一般同時表現出多重心血管危險因素。隨著(su zhe)社會經濟和生活方式的改變, MS的患病率逐年上升。MS已成為一種新的慢性病和公共衛(wèi)生問題13。雖然臨床上對MS早有認識,但有許多問題尚未解決。MS為多重危險因素聚集所致,綜合干預為其主要防治(fngzh)手段。聚合藥片（Polypill）可降低心血管疾病風險。聚合食譜作為一種不使用藥物的安全、廉價、美味的療法，有望取代“聚合藥片”。從中藥等其他醫(yī)療保健系統(tǒng)獲得膳

8、食預防或干預的新見解。對APOE * 3leiden CETP轉基因小鼠給予中藥制劑sub885c后，其血漿和肝臟脂質沉積產生的影響進行分析。sub885c是根據中藥組方原理制得的含有八種天然成分的多組分制劑。其核心處方是中國用于治療代謝綜合征和早期2型糖尿病與肥胖的藥物。據報道，與對照組相比，在糖尿病前期對APOE * 3leiden CETP小鼠的干預研究表明sub885c能顯著提高胰島素的敏感性。同時，sub885c對其他抗炎活性成分代謝的影響已有報道。因此，我們推測，sub885c對脂質代謝和胰島素敏感性發(fā)揮多靶向作用。為了研究這個問題，用有輕度高膽固醇血癥和肥胖的雌性APOE*3le

9、iden CETP轉基因小鼠設計一個平行對照的干預研實驗。APOE * 3leiden.cetp小鼠模型是通過雜交獲得的APOE * 3leiden小鼠，小鼠能表達人類CETP。它可以產生類似人類的降脂和對高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）提高干預的反應。結果參數包括體重，食物的攝入量，血漿脂質、脂蛋白及血漿和肝臟脂質沉積。大麻素1型受體（CB1）拮抗劑利莫那班作為研究中評估控制體重和代謝反應的一般藥物。本文進一步探索了3T3-L1脂肪細胞的脂肪形成和脂肪水解。材料與化學試劑sub885c由八中天然成分（山楂，荷葉，羅布麻葉，玫瑰花，大黃，芒硝，海藻，甘草）的干燥切片的水提物組成。將其干燥成固體

10、，作為制劑的干預研究。對小鼠的干預研究24只ApoE*3Leiden.CETP轉基因小鼠（610周齡）動物給予為期四周的半合成的改性西式食物，其中含0.2%的膽固醇，15%的飽和脂肪和40%的蔗糖。形成輕度高膽固醇血癥和體重增加的動物模型。在此期間，按照小鼠體重與血漿甘油三酯（TG）水平（禁食4小時后），分為三組，每組八只動物（對照組，利莫那班和sub885c組）。劑量均為10毫克/公斤/天，且每組均添加調味方糖。每只老鼠的體重和食物攝入量在第0，2，3，4，9，11，14，21，28天分別測定。多路徑效應評價脂類組學搜集血樣從第0周到4周通過CB 300 LH microvettes進行尾靜

11、脈取血獲得。血漿樣品收集的血液樣本在6000轉4時離心10分鐘。在干預結束時（4周），動物迅速采用CO2的窒息。冰上進行肝臟解剖獲得樣本稱重后快速冷凍在液氮中。血漿和肝臟樣本均存儲在-80備用。脂肪細胞的研究采用3T3-L1前脂肪細胞株（ATCC）進行研究，3T3-L1細胞經培養(yǎng)及分化成為成熟的脂肪細胞。4毫升甲醇提取物中可獲得300g的sub885c。甲醇提取液蒸發(fā)后，使其溶解在100ml二甲基亞砜中。為了研究脂肪水解，生長培養(yǎng)基除去后每孔用1毫升HBSS沖洗兩次。然后，每孔加入250mlHBSS，其中含有2%的BSA和2.5l用DMSO稀釋的sub885c提取物。在2.5ml二甲基亞砜中加

12、入1mM異丙腎上腺素作為陽性對照。加入2.5ml二甲基亞砜或不加任何藥液作為陰性對照。孵育3小時后釋放的甘油用一個商業(yè)脂肪水解測定試劑盒測定。對于添加sub885c的脂肪轉化分析在細胞分化時開始。sub885c提取液與分化培養(yǎng)基一樣，采用不同的稀釋度。介質置換均需添加新鮮的提取物。經過九天的分化，對細胞轉化為脂肪的量進行測量。血漿生化(shn hu)分析和脂蛋白分析等離子體(dnglzt)膽堿(dn jin)，TG，HDL-C，脂蛋白，CETP水平與丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性在第0周和4周測定。血漿總膽固醇（TC）和甘油三酯濃度均采用酶法試劑盒測定。用快速高效液相色譜法測定混合脂蛋白。用新

13、鮮的樣品測定TC，TG和磷脂含量。使用磷酸脂B試劑盒測定磷脂。載脂蛋白沉淀后用血漿中HDL-C定量測定血漿高密度脂蛋白。因此，10l肝素和10l0.2mol/LMnCl2加到20l血漿中，混合物孵育20分鐘，在室溫下在13000克轉速4下離心15分鐘?；旌蠘悠肥褂肂oehringer測定血漿ALT。3H-膽固醇在24小時4平衡后的血漿膽固醇在3小時。隨后37uc孵育，含有apoB脂蛋白的肝素/ MnCl2除了沉淀。從脂肪中的沉淀物和標記的膽甾醇酯標記的未酯化的膽固醇對硅膠柱，用液體閃爍計數法分離提取。脂類組學分析對血漿脂質提取血漿樣品解凍至室溫并用 CH2Cl2/MeOH 2:1提取。取30l

14、含有肝素鈉的血漿置于2ml小瓶中。首先添加30l加了內標（IS）組成的混合物（lpc-19:0，pe-30:0，pc-38:0和tg-45:0相應濃度分別為30，30，150和60g/ml)，其次依次加入190l甲醇和380l二氯甲烷?；旌锨昂筮M行徹底的渦旋。再次加入120l渦旋。6000克轉速10離心10分鐘，取300l轉移到一個新的自動采樣瓶中并存儲在-20備用。進行LC-MS分析，取脂質提取物25l，用475l乙腈/ IPA /水65:30:5（V / V / V）稀釋，取10l進樣。肝脂質提取樣本冷凍肝樣品存放在-80凍干并磨成粉。稱取十毫克的肝粉置于干凈的1.5 mlEP管中以便于隨

15、后進行的脂質提取。肝脂質提取用CH2Cl2/MeOH混合物（2:1，VV）進行液-液萃?。↙LE）實現。最終的萃取液稀釋40倍,取10l進行LC-MS分析。LC-MS脂質分析LC-MS的分析是一個混合的液相色譜分析的線性離子阱傅立葉變換離子回旋共振質譜系統(tǒng)。使用這種方法，七種不同的脂質類，包括極性脂質如溶血磷脂酰膽堿（LPC），溶血磷酸乙醇胺（LPE），磷脂酰膽堿（PC），磷酸乙醇胺（PE），鞘磷脂（SPM）和非極性脂質如膽固醇酯（CHES）和TG從柱離子電噴霧電離正離子模式洗脫。MS檢測是在全掃描模式進行一系列的質荷比（M / Z）4001500。血漿和肝臟樣本分別進行檢測。脂類組學數據處理

16、結果sub885c不影響APOE * 3leiden.cetp小鼠的食物攝入量和體重與對照組相比，在前20天sub885c沒有對載脂蛋白E * 3leiden.cetp小鼠的食物攝入量產生影響，沒有影響平均體重，21天之后，sub885c組小鼠食物攝入量增加。給予利莫那班的小鼠在前2天表現出食物的攝入量減少趨勢。平均體重顯著減少。圖1。sub885c降低血漿膽固醇，甘油三酯和增加HDL-C的含量與對照組相比，4周后sub885c治療組小鼠血漿中膽堿含量顯著下降（P0.01）圖2A。在為期4周的干預期間，sub885c治療組和對照組血漿TG水平分別降低67%（P0.01）和46%（P0.01）。

17、4周時，sub885c組TG水平往往是低于對照小鼠（圖2A），但這種差異并未達到顯著（P = 0.06）。與對照組相比，sub885c組血漿HDL-C顯著增加39%（P0.05）。脂蛋白組分的分析表明，與對照組相比，sub885c治療引起極低密度脂蛋白減少3倍，甘油三酯和極低密度脂蛋白磷脂減少2.5倍（2 BD圖）。載脂蛋白E * 3leiden.cetp小鼠，血漿TC隨著低密度脂蛋白膽固醇的降低而降低；而血漿HDL-C隨著HDL-C含量的增加而明顯增加。與對照組相比，利莫那班治療組小鼠血漿膽堿顯著降低（P0.05）。然而，血漿甘油三酯和HDL-C到干預結束時都沒有顯著的變化。三組小鼠均無不良

18、體征且ALT水平也在參考范圍。sub885c降低血漿(xujing)CETP水平和活性與對照組相比(xin b)，sub885c干預(gny)組（圖2A）APOE * 3-leiden.cetp小鼠CETP水平和活性分別顯著降低31%（P0.001）和74% (P0.001）。然而，利莫那班沒有顯著影響在相同的實驗條件下CETP的水平或CETP活性。脂類組學揭示了sub885c產生的脂質變化選取血漿和肝臟脂質沉積中兩個主成分，這兩個主成分含量分別為67%和57（圖3A，B）。在PCA雙標圖表明了對照組和sub885c組小鼠兩組間血漿和肝臟脂質的主要變化。結果發(fā)現，86（61%）22（16%）的

19、血漿和肝臟脂質的140和137分別sub885c干預4周血脂水平與對照組相比顯著改變后。在sub885c干預下血漿和肝中15種血脂變化明顯（表S2和S3）。相關分析表明，數據與正態(tài)分布的皮爾森和未經Spearman，是來評估這些脂質在血漿和肝臟中的濃度有關系。只有TG-O（50:0）顯示其血漿和肝臟濃度呈正相關關系；其他無明顯相關性。MTC分析后，三組顯著改變的肝脂質和68的70（97%）顯著改變血脂下調sub885c處理。sub885c能刺激脂肪分解和抑制體外脂肪生成探討sub885c對3T3-L1脂肪細胞的水解作用，用sub885c孵育后測定介質釋放的甘油。陽性對照異丙腎上腺素，是已知的能

20、引起Tg水解增加，刺激3T3-L1脂肪細胞水解的一種非選擇性的-腎上腺素能受體激動劑，（圖4a）。稀釋500倍后，與20M異丙腎上腺素對照組相比，sub885c提取物引起的甘油的釋放高出22%。當sub885c提取物稀釋2500倍后，甘油釋放低于20M的異丙腎上腺素達到20%，但仍高于DMSO和空白組。作為陽性對照的細胞因子腫瘤壞死因子-（TNF-），它會干擾脂肪細胞的分化。研究發(fā)現sub885c存在劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)的脂肪細胞（圖4b）。其他的稀釋液沒有明顯表現出對細胞形態(tài)的影響。TNF-，作為對照，并沒有顯示出任何對核數和密集的細胞層的影響。討論本研究表明，基于對代謝組學的多組分制劑

21、的分析可以用來研究潛在的目標或新成分。在以前的研究中發(fā)現sub885c通過提高胰島素的敏感性而控制前期糖尿病，APOE * 3leiden老鼠喂食高脂肪的飲食10周造成APOE * 3leiden.cetp小鼠模型，該模型可以降低血脂和增加HDL-C 顯示它的干預作用。在本研究中，sub885c顯示了多個效應來改善脂質代謝，并總結在圖5。具體地說，sub885c治療誘導血漿高密度脂蛋白膽固醇增加，同時伴隨著低密度脂蛋白水平的減少。產生的作用通常被視為抗動脈粥樣硬化。高密度脂蛋白代謝的重要調節(jié)器，CETP的水平和活性降低可能與三酰甘油水平降低有關。綜上，sub885c對HDL-C的影響可能是由于

22、：1）降低CETP活性和CETP水平；2）降低LDL水平；3）提高胰島素的敏感性。sub885c顯著降低血漿TC，這可能反映了減少（V）治療小鼠sub885c LDL-C濃度。sub885c的影響可能更多的是與血漿脂蛋白代謝。sub885c證實（不是利莫那班）顯著降低3leiden.cetp APOE *CETP小鼠CETP的水平和活性（圖2A）。在表2中，sub885c與一些有效藥物相比（即利莫那班，阿托伐他汀，托塞曲匹，煙酸和替格列扎）均可用于調節(jié)血脂水平。由于不同的藥物有不同的設計，沒法對它們進行詳細的比較，但與這些藥物引起的副作用比較，如精神異常（利莫那班），嚴重的潮紅（煙酸），頭痛（阿托伐他?。难芗膊〉陌l(fā)病率和死亡率增加的風險（托塞曲匹），腎小球濾過率升高的血清肌酐和相關的減少（替格列扎）；而與sub885c相關報告的副作用稀少。只有藥材含蒽醌類（即大黃素大黃酚）的報道引起腹瀉。因此，sub885c可能比其他的治療措施有更高的效益風險。與利莫那班相反(xingfn)，sub885c在4周的干預(gny)期間沒有減輕小鼠體重或食