生物化學(xué)酶[1]

1、 第 四 章 酶化學(xué)（Enzyme)生物化學(xué)酶1學(xué)習(xí)目的與要求：1. 酶的概念及發(fā)展分類及命名 5.酶作用的機(jī)制2.酶催化作用的特點(diǎn) 6.酶促反應(yīng)的速度及其影響因素3.酶的化學(xué)本質(zhì)及組成 7.酶的分離純化與酶活力測(cè)定4.酶結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系 8.酶的多樣性重點(diǎn)：1.酶的化學(xué)本質(zhì)及組成 4.酶促反應(yīng)的速度及其影響因素2.酶結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系 5.酶的分離純化與酶活力測(cè)定3.酶作用的機(jī)制難點(diǎn)：1.酶作用的機(jī)制 3.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響2.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響 4.酶活力測(cè)定生物化學(xué)酶1第一節(jié)、酶的概念，分類及命名一.酶的概念及發(fā)展 酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用和高度專一性的特

2、殊蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)單說，酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的生物催化劑。酶的概念生物化學(xué)酶1發(fā)展史(1)酶是蛋白質(zhì): 1926年,James Summer由刀豆制出脲酶結(jié)晶確立酶是蛋白質(zhì)的觀念，其具有蛋白質(zhì)的一切性質(zhì)。(2)核酶的發(fā)現(xiàn)： 19811982年，Thomas R.Cech實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有催化活性的天然RNARibozyme。 L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA組分具有酶活性是兩個(gè)最著名的例子。 1995年，發(fā)現(xiàn)DNA的催化活性。(3)抗體酶（abzyme）： 1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)制備了具有酶活性的抗體（catalytic antibody

3、）。生物化學(xué)酶1二. 酶的分類氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1.氧化-還原酶 Oxidoreductase生物化學(xué)酶1轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2.轉(zhuǎn)移酶 Transferase生物化學(xué)酶1水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)3.水解酶 Hydrolase生物化學(xué)酶1裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或

4、 原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。 主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4. 裂解酶 Lyase生物化學(xué)酶1異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。5.異構(gòu)酶 Isomerase生物化學(xué)酶1合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng) 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6.合成酶 Ligase or Synthetase生物化學(xué)酶

5、1三. 酶的命名（1）根據(jù)其催化底物來命名；（2）根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；（3）結(jié)合上述兩個(gè)原則來命名；（4）有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)。1.習(xí)慣命名法2.國際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì),2個(gè)底物，底物之間“ ：”，水解酶水解2字可省略，最后加一個(gè)酶字。例如：(習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶) 系統(tǒng)名稱:L-丙氨酸 ：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 酶催化的反應(yīng): 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸生物化學(xué)酶1四.酶的編號(hào)例如： RNaseT1-EC3148 EC - 酶 3 - 水解酶 1 - 脂鍵 4 - 磷酸二酯鍵 8 - 編號(hào)（第8個(gè)）生物化學(xué)酶1第二節(jié)、

6、酶催化作用的特點(diǎn)一.酶和一般催化劑的共性及酶催化作用特性1.酶和一般催化劑的共性：加快反應(yīng)速度；不改變平衡常數(shù)；自身不參與反應(yīng)。2.酶催化作用特性：條件溫和：常溫、常壓、pH=7；高效率：反應(yīng)速度與不加催化劑相比可提高108 1020，與加普通催化劑相比可提高1071013；專一性：即酶只能對(duì)特定的一種或一類底物起作用。易變敏感性：易受各種因素的影響。酶的活性調(diào)節(jié)控制：受在活細(xì)胞內(nèi)受到精密嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制。酶分子代謝更新：生物化學(xué)酶1二.專一性1.絕對(duì)專一性有些酶只作用于一種底物，催化一個(gè)反應(yīng)， 而不作用于任何其它物質(zhì)。2.相對(duì)專一性這類酶對(duì)結(jié)構(gòu)相近的一類底物都有作用。3.立體異構(gòu)專一性簇（基團(tuán)

7、）專一性鍵專一性旋光異構(gòu)專一性。幾何異構(gòu)專一性生物化學(xué)酶1第三節(jié)、酶的化學(xué)本質(zhì)及組成一.酶的化學(xué)本質(zhì)1.由基本組成單位氨基酸2.具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)-兩性離解性質(zhì)等3.具有雙縮脲反應(yīng)二.酶的組成全酶(holoenzyme）= 酶蛋白 + 輔因子單成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)）雙成份酶（結(jié)合蛋白質(zhì)）酶 酶蛋白（apoenzyme） 輔因子（cofacter) 輔酶（coenzyme) 輔基(prosthetic group)生物化學(xué)酶1三.酶的輔因子酶的輔因子是酶的對(duì)熱穩(wěn)定的非蛋白小分子物質(zhì)部分，其主要作用是作為電子、原子或某些基團(tuán)的載體參與反應(yīng)并促進(jìn)整個(gè)催化過程。(1)

8、傳遞電子體：如 卟啉鐵、鐵硫簇；(2)傳遞氫（遞氫體）：如 FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)傳遞?；w：如 C0A、TPP、硫辛酸；(4)傳遞一碳基團(tuán)：如 四氫葉酸；(5)傳遞磷酸基：如 ATP，GTP；(6)其它作用： 轉(zhuǎn)氨基，如 VB6 ；傳遞CO2，如 生物素。生物化學(xué)酶1第四節(jié) 酶分子結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系一.酶分子結(jié)構(gòu)根據(jù)結(jié)構(gòu)不同酶可分為單體酶：只有單一的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成。寡聚酶：由多個(gè)（兩個(gè)以上）具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基聚合而成。多酶復(fù)合體：由幾個(gè)功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。生物化學(xué)酶1二.活性中心活性中心：酶分子中直接和底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的空間局限（部位）

9、。 結(jié)合部位(Binding site)：酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。生物化學(xué)酶1催化部位(Catalytic site): 酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結(jié)合部位決定酶的專一性，催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。生物化學(xué)酶1調(diào)控部位(Regulatory site):酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對(duì)酶起激活或抑制作用生物化學(xué)酶1三.必須基團(tuán)酶表現(xiàn)催化活性不可缺少的基團(tuán)。親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團(tuán)：門冬

10、氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。親核性基團(tuán)酸堿性基團(tuán)生物化學(xué)酶1第五節(jié)、酶作用的機(jī)制一.酶催化作用與反應(yīng)活化能自由能反應(yīng)進(jìn)程產(chǎn)物反應(yīng)物IIIIIII： 酶催化反應(yīng)活化能II： 化學(xué)催化劑反應(yīng)活化能III：無催化反應(yīng)活化能生物化學(xué)酶1二.酶催化作用的中間產(chǎn)（絡(luò)合）物學(xué)說在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化,中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。E + S = E-S P + E許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了ES復(fù)合物的存在。ES復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。生物化學(xué)酶1三. 使酶具有高效性的機(jī)制1.臨近定向

11、效應(yīng)在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn).2.“張力”和“形變” 底物與酶結(jié)合誘導(dǎo)酶的分子構(gòu)象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”甚至“形變” ，從而促使酶底物中間產(chǎn)物進(jìn)入過渡態(tài)。生物化學(xué)酶13.酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸堿催化方式。廣義酸堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子

12、的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。酶活性部位上的某些基團(tuán)可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化。His 殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。廣義酸基團(tuán)（質(zhì)子供體）廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子受體）生物化學(xué)酶14.共價(jià)催化催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價(jià)催化。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括 His 的咪唑基，Cys 的巰基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。生物化學(xué)酶1四.酶專一性的機(jī)制認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與

13、底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣1.鎖鑰假說(lock and key hypothesis)生物化學(xué)酶1該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.2.誘導(dǎo)契合假說（inducedfit hypothesis)生物化學(xué)酶1第六節(jié)、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響 在酶濃度，pH，溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系。如右圖所示：在低底物濃度時(shí), 反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，底物濃度增加，反應(yīng)速度增加，表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)特征當(dāng)?shù)孜餄舛?，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合

14、后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。生物化學(xué)酶1二.米氏方程1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對(duì)酶促反映的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。Km 米氏常數(shù)Vmax 最大反應(yīng)速度生物化學(xué)酶1三.米氏方程的推導(dǎo)根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:生物化學(xué)酶1生物化學(xué)酶1 Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。 四.米氏常數(shù)Km的意義1.米氏常數(shù)的含義由米氏方程可知，當(dāng)反應(yīng)速度等于

15、最大反應(yīng)速度一半時(shí),即V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。2.酶的特征物理常數(shù)不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。3.表示酶與底物之間的親和程度生物化學(xué)酶14.判斷酶的最適底物Km最小的底物5.計(jì)算一定速度下的底物濃度V= 80% Vmax 時(shí)， (S)=？ 由： 0.8 Km + 0.2 (S)= (S), 0.8 Km = 0.2 (S) (S)=4 Km 又: V= 99%

16、Vmax , (S)= 99 Km6.了解酶的底物在體內(nèi)的濃度水平Km (S)7.判斷反應(yīng)的方向Km最小的反應(yīng)8.判斷抑制作用的類型生物化學(xué)酶11.雙倒數(shù)作圖法 1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：五.米氏常數(shù)Km的測(cè)定測(cè)定Km和V的方法很多，最常用的是LineweaverBurk的作圖法 雙倒數(shù)作圖法。1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km生物化學(xué)酶1V/(S)VmaxVVmax/Km斜率=-Km2.Eadie-Hofstee方程由：方程兩邊乘以Km +（S）/（S）V(Km+（S）/ （S）)V=- Km(V/ （S）)+VmaxV V/(S)

17、作圖生物化學(xué)酶1最適溫度第七節(jié) 影響酶促反應(yīng)速度的因素一.溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。 因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。 在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。生物化學(xué)酶1二.pH對(duì)酶反應(yīng)的影響在一定的pH下, 酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。生物化學(xué)酶1生物化學(xué)酶1速度酶濃度三.酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響在底物足夠過量而其它條件固定的情況下，并且反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素時(shí)，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比生物化學(xué)酶1四.激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響1.概念：凡是能提高酶

18、活力的物質(zhì)(簡(jiǎn)單化合物)都稱為酶的激活劑。 （activator)。2.成分：其中大部分是一些無機(jī)離子和小分子簡(jiǎn)單有機(jī)物。 如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、 Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4- 、GSH 、VitC 等；3.功能：1）.這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合， 可能是酶活性部位的組成部分， 2）.也可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分起作用；4.特點(diǎn)：1）.一般情況下，一種激活劑對(duì)某種酶是激活劑，而對(duì)另 一種酶則不一定是激活劑，可能發(fā)生抑制作用； 2）.對(duì)于同一種酶，不同激活劑濃度會(huì)產(chǎn)生不同的作用。生物化學(xué)酶1

19、 五.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響（一）.酶的抑制作用的概念有些物質(zhì)能與酶分子上某些必須基團(tuán)結(jié)合（作用),使酶的活性中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。抑制劑： 能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑 （inhibitor)。 抑制作用的特點(diǎn)：酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。生物化學(xué)酶1（二）.抑制作用的類型1.不可逆抑制作用抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。 生物化學(xué)酶12.

20、可逆抑制作用： 抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制：概念：某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。特點(diǎn)：竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競(jìng)爭(zhēng)能力來消除。生物化學(xué)酶1競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用下式表示：生物化學(xué)酶1生物化學(xué)酶1生物化學(xué)酶1競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程：有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，Km值增大(1+I/Ki)倍， 且Km值隨I的增高而增大；在E固定時(shí)，當(dāng)

21、S Km (1+I/Ki), Km (1+I/Ki)項(xiàng)可忽略不計(jì)， 則v= Vmax，即最大反應(yīng)速度不變。生物化學(xué)酶1競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的LineweaverBurk圖 ：生物化學(xué)酶1（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：概念：酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競(jìng)爭(zhēng)與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。特點(diǎn)：非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。生物化學(xué)酶1非競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用下式表示：生物化學(xué)酶1生物化學(xué)酶1非競(jìng)

22、爭(zhēng)性抑制作用的速度方程：有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，V值減小(1+I/Ki)倍， 且V值隨I的增高而降低；Km值不變。生物化學(xué)酶1非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的LineweaverBurk圖 ：生物化學(xué)酶1（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：概念：酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合， 引起酶活性下降。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用下式表示：特點(diǎn)：非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。生物化學(xué)酶1有反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，Km和V值均減小(1+I/Ki)倍，且都隨I的增高而降低。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程：生物化學(xué)酶1反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的LineweaverBurk圖 ：生物化學(xué)酶1第八節(jié)、酶的分離純化與酶活力測(cè)定一.酶的分離純化1

23、.基本原則 提取過程中避免酶變性而失去活性 防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等 要求在低溫下操作 加入的化學(xué)試劑不使酶變性 操作中加入緩沖溶液生物化學(xué)酶12.基本操作程序選材：微生物（微生物發(fā)酵物: 胞內(nèi)酶，胞外酶），動(dòng)物（動(dòng)物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進(jìn)行細(xì)胞破碎（機(jī)械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等），分離：先進(jìn)行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，超離心等）。純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。生物化學(xué)酶13.酶的制劑形式固體：干

24、燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥）液體：溶液4.保存低溫下短期保存0-4（固體）-20-70（液體）生物化學(xué)酶1二.酶活力的測(cè)定1.酶活力概念酶活力：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來表示。酶活力可用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為mol/min等。2.酶活力的表示方法-酶活力單位酶活力單位的基本定義為： 規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。據(jù)不同情況有幾種酶活力單位（activity unit）或又稱酶單位（enzyme unit）生物化學(xué)酶1國際單位U（Unit）：是以最

25、佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1mol產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。“Katal”單位：是指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。Kat和U的換算關(guān)系：1 Kat=6107U，1U=16.67n Kat 以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個(gè)以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個(gè)酶單位表示1分鐘使1mol有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化的酶量。 如果是兩個(gè)相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2mol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個(gè)酶單位。 在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計(jì)算。生物化學(xué)酶1習(xí)慣單位在實(shí)際使用中，不同酶有各自的規(guī)定，如：-淀粉酶活力單位：每小時(shí)分

26、解1g可溶性淀粉的酶量為一個(gè)酶單位。（QB546-80），也有規(guī)定每小時(shí)分解1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精的酶量為一個(gè)酶單位。顯然后者比前一個(gè)單位小。糖化酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶單位。蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸所需的酶量。DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，一小時(shí)內(nèi)可完全消化1g純化的DNA所需的酶量。生物化學(xué)酶13.酶的比活力比活力:指每mg酶蛋白質(zhì)/蛋白氮所含的酶活力單位數(shù)。比活力=U或Kat/mg酶蛋白或蛋白氮(U或Kat/ml酶液,或U或Kat/mg酶制劑）比活力表示酶制劑的純度的一個(gè)

27、指標(biāo)。4.酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù)酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù):表示酶的催化中心的活性,單位時(shí)間內(nèi)(sec.)每一催化中心的活性或活性中心所轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，或每mol酶活性中心單位時(shí)間轉(zhuǎn)換底物的mol數(shù).轉(zhuǎn)換數(shù)=k3=Vmax/(E0)生物化學(xué)酶15.酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定就是測(cè)定一定量的酶，在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（減少）量。即測(cè)定時(shí)確定三種量：加入一定量的酶；一定時(shí)間間隔；物質(zhì)的增減量。1）.測(cè)定酶活力常有以下幾種方法反應(yīng)計(jì)時(shí)法：反應(yīng)計(jì)時(shí)必須準(zhǔn)確。反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)到時(shí)，要立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時(shí)間。終止酶反應(yīng)。常使酶立刻變性最常

28、用的方法：是加入三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白沉淀。也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來停止反應(yīng) 。生物化學(xué)酶1反應(yīng)量的測(cè)定法：測(cè)底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應(yīng)過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測(cè)定，所以大都測(cè)定產(chǎn)物的生成量2).酶活力測(cè)定的分析方法具體物質(zhì)量的測(cè)定，據(jù)被測(cè)定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過定量分析法測(cè)定。常用的方法有：光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個(gè)可用分光光度法或熒光光度法測(cè)出的化合物?；瘜W(xué)法：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。 放射性化學(xué)法：用同位素標(biāo)記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時(shí)間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。 生物化學(xué)酶1第九節(jié) 酶的多樣性一.多酶復(fù)合體由幾個(gè)功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。二. 同工酶催化同一化學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同的一類酶如：人乳酸脫氫酶LDH1 H4 73 2 43 14 10 0 43 12 27.1LD