SOD活性的測定鄰苯三酚自氧化法

1、SOD活性的測定-鄰苯三酚自氧化法定義：25C時抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時所需的SOD量為一個活力單位。按照GB/T5009.171-2003中鄰苯三酚自氧化的方法測定酶活力，利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O-,生成帶色的中2間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后先變成黃綠色，幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，線性時間維持在34min。加入酶液則抑制其自氧化速度，在325nm處測定溶液的吸光度。酶活性單位采用ImL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶定量為一個活力單位。一、試劑：1、pH7.8,0.05mol/L的磷酸緩沖液：A液：稱取17.9gNaHPO12HO于容量瓶中定容至1L；242B液：

2、稱取7.8gNaHPO2HO于容量瓶中定容至1L；242取A液91.5mL和B液體8.5mL混勻得到pH7.8,0.05mol/L的磷酸緩沖液。2、C液：pH8.20,0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(內(nèi)含1mmol/LEDTA2Na)：稱取1.2114gTris和37.2mgEDTA2Na溶于62.4mL0.1mol/L鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100mL。3、0.lmol/L鹽酸溶液：量取2.lmL12mol/L鹽酸,蒸餾水定容至250mL。4、.10mmol/L鹽酸溶液:量取10mLO.lmol/L鹽酸，蒸餾水定容至l00mL。5、D液:4.5mmol/L鄰苯三酚

3、鹽酸溶液：稱取鄰苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的鹽酸溶液，并定容至100mL。二、儀器：冷凍離心機(jī)水浴鍋；3電子天平；4紫外-可見分光光度計；精密酸度計，精確到0.01pH；10mL比色管；10mL離心管；玻璃乳缽。三、實驗步驟1.SOD粗酶液的提取稱取葉片lg,置于研缽中研磨，加入3mL0.05mol/L磷酸緩沖液,加入少量石英砂，繼續(xù)在冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，取4mL至離心管中，于4C10000r/min離心20min，上清液即為SOD粗提液。2.1鄰苯三酚自氧化速率測定在25C左右，于10mL比色管中依次加入C液體2.35mL,磷酸緩沖液2.00mL,D液0.1

4、5mL。加入D液后立即混合均勻并傾入比色皿，分別測定在325nm波長條件下初始時和lmin后吸光值，二者之差即鄰苯三酚自氧化速率AA(min-i)。3252.2樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率測定樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率測定按照2.1步驟分別加入一定量樣液使抑制鄰苯三酚自氧化速率約為1/2AA(min-i)，即A325A(min-i)。325SOD活性測定加樣表試液空白酶提取液1酶提取液2C液/mL2.352.352.35磷酸緩沖液/mL21.51.5樣液/mL00.50.5D液/mL0.150.150.15于10mL比色管中立即混合均勻然后傾入比色皿式中:U/mL一SOD酶活力單位；A一鄰苯三酚自氧化速率;325A、一樣液或SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率;325V所加酶液或樣液體積，單位為毫升(mL);D酶液或樣液的稀釋倍