生化儀檢測原理及應用

1、生化儀檢測原理及應用銀聯(lián)立生化分析技術基本原理：生化分析技術基本原理：1：反射分析技術原理：反射分析技術原理：儀器內部光源發(fā)出一束光透過透明支持層，在試劑層光被有色化合物部分吸收后，在擴散層提供的反射面被反射，反射光經濾光裝置后回到光度檢測器被讀數(shù)。光密度由此被轉化為電壓讀數(shù)，并計算成分析物濃度。2散射免疫比濁法技術原理：散射免疫比濁法技術原理：是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液使遇到抗原抗體復合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉，光線偏轉的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復合物顆粒大小和多少密切相關。散射光的強度與復合物的含量成正比。3. 透射免疫比濁法的技術原理：透射免疫比濁法的技術原理

2、：是測定一定體積的溶液通過的光線量，當光線通過時，由于溶液中存在的抗原抗體復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測定的光通量和抗原抗體復合物的量成反比。化學發(fā)光技術基本原理：化學發(fā)光技術基本原理： 1：電化學發(fā)光分析技術（：電化學發(fā)光分析技術（ECL）：）：是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應。包括了兩個過程，發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及反應參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原成激發(fā)態(tài)的二價釕，隨即釋放光子恢復為基態(tài)的發(fā)光底物。 （發(fā)光標記物-三聯(lián)吡啶釕） 代表儀器品牌-德國羅氏德國羅氏Cobas E601 2：化

3、學發(fā)光標記免疫分析：化學發(fā)光標記免疫分析： 化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析(CLIA ) , 是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物acridin ium ester (A E) , 是有效的發(fā)光標記底物 , 其通過起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O 2 ) 作用而發(fā)光, 強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內完成, 為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析, 其化學反應簡單、快速、無須催化劑; 檢測小分子抗原采用競爭法, 大分子抗原則采用夾心法 , 非特異性結合少, 本底低; 與大分子的結合不會減小所產生的光量, 從而增加靈敏度。 代表儀器品牌

4、-美國貝克曼美國貝克曼DXC800 DXC800照片3.干化學反射分析技術原理及優(yōu)點：干化學反射分析技術原理及優(yōu)點： 與普通生化儀比較，干化學被測物質的化學反應是在干燥的基質中進行，入射光通過基質被吸收后，檢測反射光的減弱程度來反映被測物質濃度的大小。 普通生化儀反應載體是水溶液，入射光被有色反應產物吸收后減弱，通過吸光度的大小來反映被測物質濃度的大小。 干化學均用一次性消耗品，無交叉污染和攜帶污染。缺點是：成本比較高。4：生化儀恒溫裝置：生化儀恒溫裝置-自動生化分析儀通過溫度控制系統(tǒng)保持溫度的恒定，以保證反應的正常進行，可以對25、30、和37三種溫度進行恒溫。保持恒溫的方式有三種： 空氣干

5、式浴恒溫空氣干式浴恒溫：在比色杯與加熱器之間隔有空氣。 優(yōu)點：方便，速度快，不需要特殊的保護。 缺點：穩(wěn)定性和均勻性稍差。 -代表儀器貝克曼代表儀器貝克曼DXC800水浴式循環(huán)加熱式水浴式循環(huán)加熱式：在比色杯周圍充盈有水，加熱器控制水的溫度。優(yōu)點：溫度準確，可達0.1。缺點：需要特殊的防腐劑才能保證水質的潔凈。-代表儀器羅氏代表儀器羅氏Modul P800 恒溫液循環(huán)間接加熱恒溫液循環(huán)間接加熱：在比色杯周圍流動著一種特殊的恒溫液（具有無味、無污染、不變質、不蒸發(fā)等特點的能夠傳導熱量的一種介質），在比色杯與恒溫液又有一個幾毫米的空氣夾縫，恒溫液通過加熱夾縫的空氣達到恒溫。 優(yōu)點：均勻性、穩(wěn)定性優(yōu)

6、于干式，又有升溫迅速，不需要特殊保養(yǎng)的優(yōu)點。5：反滲透純水系統(tǒng)：反滲透純水系統(tǒng)： 原水為自來水，首先經過機械過濾器，去除混在水中的鐵銹、砂、紅蟲、膠體等大顆粒雜質；首級過濾后的水進入活性碳濾器，活性炭對水中的余氯、有機物及異味有極高的去除效果；然后經過軟水處理器去除水中造成結垢的鈣、鎂等離子，變成軟水。經過處理后出來的水，再經過5m保安過濾器，防止預處理濾料微粒及5m以上的雜質進入反滲透系統(tǒng)，再經高壓泵增壓1.0MPa或1.5MPa，在此壓力下，反滲透析出純水，然后送到純水箱。 1級別 分析實驗室用水的原水應為飲用水或適當純度的水。 分析實驗室用水共分三個級別：一級水、二級水和三級水。 2一級

7、水 一級水用于有嚴格要求的分析試驗，包括對顆粒有要求的試驗。如高效液相色譜分析用水 一級水可用二級水經過石英設備蒸餾或離子交換混合床處理后，再經o2pm微孔濾膜過濾來制取。 3二級水 二級水用于無機痕量分析等試驗，如原子吸收光譜分析用水。 二級水可用多次蒸餾或離子交換等方法制取。 4三級水 三級水用于一般化學分析試驗。 三級水可用蒸餾或離子交換等方法制取。 5貯存 各級用水在貯存期間，其沾污成分的主要來源是容器可溶成分的溶解、空氣中二氧化碳和其他雜質。因此，一級水不可貯存，使用前準備.二級水、三級水可適量準備，分別貯存在預先經同級水清洗過的容器中。 各級用水在運輸過程中應避免沾污。5.2水質常

8、引起的問題：水質常引起的問題： Frequent Calibrations 頻繁的校正頻繁的校正 High CV% 高高CV Fluctuation in quality results over the day/week/month 積累和波動現(xiàn)象積累和波動現(xiàn)象 Interfered assays 直接干擾分析直接干擾分析分析儀參數(shù)設定及相關資料：分析儀參數(shù)設定及相關資料：7600基本設置雙波長：雙波長：有兩個不同的波長即測量波長（主波長）和參比波長（次波長）。由檢測器測出的吸收度是這兩個波長下吸收度的差值A。A與被測定物質的濃度成正比，這個方法稱雙波長法。雙波長差吸光度法具有可以克服樣本混

9、濁（溶血、脂血、黃疸）、共存組分吸收譜線疊加的干擾，以及減少比色杯的光學不均一等優(yōu)點?？瞻卓瞻?blank)校正校正:在分光光度法中，常利用空白溶液來調節(jié)儀器的吸光度零點，或用來抵消某些測定的干擾因素。濕化學常見的比色分析反應類型：濕化學常見的比色分析反應類型：直接測量：具有特征性的吸收峰，不經過任何反應直接在指定波長測量；單一反應：待測反應本身有特征性吸收峰的底物或產物量的變化；如ALB測定原理：白蛋白+BCG-白蛋白-溴甲酚綠復合物溴甲酚綠復合物在波長為570nm處吸光度最強，固此法ALB主波長應設定在570nm；偶聯(lián)反應：底物或產物無特征性吸收峰，需經過其他反應生成有特征性的吸收峰測量的

10、化合物，這種反應稱為指示反應。如ALT測定原理：L-丙氨酸+酸戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+ 乳酸+ NAD NADH在340nm處吸光度最強，其吸光度與NADH的濃度成正比，固ALT此法檢測主波長應設定在340nm處。一點終點法：當待測物與試劑反應到達平衡，測定其吸光度，計算待測物濃度，該法在標本正常情況下較穩(wěn)定，若空白對照較大時（如有干擾吸光度物質）影響檢測真實值。2、兩點終點法：在被測物反應或指示反應未開始時，選擇第一個吸光度點，在反應到達平衡后選擇第二個吸光度點，兩點吸光度點之差用于計算結果。此法能有效減少標本溶血、脂血、黃疸造成的干擾。 3、連續(xù)監(jiān)測法：在零級反應期

11、連續(xù)測定酶促反應過程中底物或產物量的變化，求出酶反應初速度，間接計算出酶活力濃度。此法主要用于酶活性及其代謝物的測定，較終點法準確。4、兩點固定時間法：指在時間-吸光度曲線上取尚在反應中的兩點間的差值來計算結果，此兩點既不是起始點也不是反應終點。此法應選用酶反應的線性期進行測定，同時還應確定該法能測定酶活性的最高限度，對于超過此限的樣品，應采用縮短反應時間或減少樣品用量的辦進行測定。常見幾種報警：常見幾種報警：臨床生化檢驗的校準與質控臨床生化檢驗的校準與質控常用的有Linear單點校準：需要設置一個標準品（濃度必須大于0），以原點和標準品的連線為校準曲線（橫坐標為濃度C，縱坐標為吸光度A）。單

12、點校準必須設置空白校準0點。Logistic-Log 4P： 標準品的數(shù)量至少為4個，其中第1個標準品的濃度為0，標準品的濃度必須從低到高的順序排列。適用于隨著濃度的增加需吸光度偏移的實驗項目的標準曲線。Spline：此校準方式要求提供26個標準品，其中第1個標準品的濃度必須為0，標準品的濃度必須從低到高的順序排列。計算方法：K因數(shù)法（1點線性法）-由空白液的標準（C1）通過公式計算得出的K因數(shù)制成的曲線。K因數(shù)法測定C1（空白試劑）的吸光度時，先輸入K值，再計算濃度值。 公式：CX=K(AX-B)+C1兩點線性法-由空白液和含有一定濃度標準液的標準2 的兩點吸光度繪制的曲線(Y=aX+b,通

13、過水來計算得到b,通過標準品來得到a.)。此法適用于所有的分析方法：1點法、2點速率法和速率法。常用項目：TP、ALB、TC、TG等多點線性（非線性）-要提供至少4個標準品，第一個為活性為0，然后用二次函數(shù)或指數(shù)來描繪校準的曲線與公式。X=K/1+A(Cx+C1)+S1ABSX：樣本吸光度或吸光度的變化量；Cx：樣本濃度；C1：標準液1濃度；常用項目：APOB、APOA、PA等。二：質控質控質控的基礎就是質控的基礎就是 正態(tài)分布圖正態(tài)分布圖。幾個概念：幾個概念：準確度準確度：一個檢測結果與可接受的參考值之間的一致程度。(ISO3534-1：1993)正確度正確度：很大一個系列檢測結果的均值與可

14、接受的參考值之間的一致程度。(ISO3534-1：1993)。與系統(tǒng)誤差有關，常用偏倚(bias)表示不正確度。精密度精密度：在規(guī)定條件下獨立檢測結果之間的一致程度（ISO3534-1：1993）。與隨機誤差有關，常用SD或CV表示不精密度。靶值與SD的設定:1 平均數(shù)和標準差 質控品的均值和標準差應建立在實驗室常規(guī)使用方法對質控品重復測定的基礎上。2 定值質控品 若使用定值質控品，使用說明書上的原有標定值只能作參考。必須由實驗室作重測定來確定實際的均值和標準差。 3 新批號質控品均值的建立 新批號質控品的每個項目都應和現(xiàn)用的質控品作平行檢測，最好是在不同天內至少作 20 瓶的檢測。若無法從

15、20 天內得到 20 個數(shù)值，至少在 5 天內，每天作不少于 4 次重復檢測來獲得。4 新批號質控品標準差的建立 若在相當長的時間內操作穩(wěn)定，有大量質控數(shù)據(jù)，則由此確定的標準差評估值應可用于新批號。但對標準差評估值應定期重新評估。若無較好的資料，則應重新作評估。最好是在 20 天得到至少 20 個數(shù)據(jù)。在以后能有較長的穩(wěn)定操作的數(shù)據(jù)時，計算的評估值更好，用其替代前者。5 累積值 由每個月質控數(shù)據(jù)對標準差的估計（對均值亦有一定影響）常因檢測數(shù)的固有困難，造成月與月之間的變異較大（例如：由20 個檢測數(shù)估計標準差，它和標準差真值間的差異可達30%；由 100個檢測數(shù)估計標準，估計值和真值的差異還要

16、大于10%）。較好的估計是將較短時間周期內的質控數(shù)據(jù)累積起來，例如，累積 6 個月連續(xù)每月質控數(shù)據(jù)成為 6 個月累積值。要注意的是作為每個月周期的均值沒有持續(xù)下降或上升的改變。 3質控統(tǒng)計方法：a L-J質控圖質控圖(最常用最常用) -L-J質控曲線，全稱Levey-Jennings。1924年，美國休哈特（W.A.Shewhart）首先提出質控圖。20世紀50年代，Levey和Jennings把質控圖引入到臨床檢驗中。（質控方法是建立在單個質控品雙份測定值的均值和極差的基礎上） Henry和Segalove對L-J質控圖（X-R）進行了修改，以20份質控品的試驗結果，計算均值和標準差，定出質

17、控限，每天或每批隨患者標本測定質控品一次，將所得的質控結果標在質控圖上。這各質控圖一般稱為單值質控圖，也就目前大家所熟悉的L-J質控圖。b Z-分數(shù)圖分數(shù)圖-z分數(shù)（z-score）,也叫標準分數(shù)（standard score）是一個分數(shù)與平均數(shù)的差再除以標準差的過程. z分數(shù)是一種可以看出某分數(shù)在分布中相對位置的方法。Z分數(shù)是以標準差為單位所表示的原始分數(shù)（x）與平均數(shù)的偏離，也可以說是一個以標準差為單位來表示的偏離分數(shù)。Z-分數(shù)圖就是將不同濃度水平的繪在同一圖上。分數(shù)圖就是將不同濃度水平的繪在同一圖上。 c Youden圖圖-制作雙值質控圖，是以低值畫在水平軸，高值畫在垂直軸，形成正方形圖

18、，正方形的中心點，即為兩個平均值的交叉點。既能區(qū)分系統(tǒng)誤差及隨機誤差，也適用于室間質量評價?？煞秩N形式：穩(wěn)定型質控圖穩(wěn)定型質控圖：兩種質控品的測定值主要變動于BC之對角線上，集中于、區(qū)，呈橢圓形分布。 隨機誤差質控圖隨機誤差質控圖：兩種質控品的測定值主要變動于AD之對角線上，集中于、區(qū)以及其外側。 系統(tǒng)誤差質控圖系統(tǒng)誤差質控圖：兩種質控品的測定值主要變動于BC之對角線上，集中于、區(qū)：以及其外側。 質控規(guī)則的選擇 警告（隨機誤差） 失控（隨機誤差/新的系統(tǒng)誤差） Westgard多規(guī)則檢索程序： 3：生化室內質控失控后的處理Westgard多規(guī)則注意問題多規(guī)則注意問題：12S警告規(guī)則，不是失控

19、規(guī)則。若本批數(shù)據(jù)無超出2S限制線（即使數(shù)據(jù)剛好落在2S限制線上），表示本批結果沒問題。沒有出現(xiàn)12S的表現(xiàn)，但數(shù)據(jù)出現(xiàn)傾向性表現(xiàn)，如多個數(shù)據(jù)偏于一側，甚至偏于+1S或-1S以外，這種情況都不屬于失控，可根據(jù)實驗室質量目標要求做相應處理。失控后不恰當?shù)淖龇ㄊЭ睾蟛磺‘數(shù)淖龇ǎ海?）重做控制品（應用12S規(guī)則時，1個控制品時的假失控報告可能性為5%，2個控制品為9%，3個控制品是時為14%，當出現(xiàn)12S表現(xiàn)后重做控制品，得到的控制值常在“限值內”，感覺“這次又正好過關了”）-延誤了解決誤差的時機，將問題留給了以后。（2）試用新的控制品-將問題簡單地推給控制品。（3）重新校準-掩蓋問題真相。 失控后比較恰當?shù)奶幚聿襟E：a檢查控制圖或失控的規(guī)則,確定誤差類型13S和R4S規(guī)則通常提示隨機誤差。22S 、41S 和10X規(guī)則