Western-blot實(shí)驗(yàn)方法步驟

1、 它結(jié)合了凝膠分辨力高和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，與免疫沉淀法比較，這種方法無需對靶蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記。幾乎總在變性條件下進(jìn)行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題。 具有從混雜抗原中檢測出特定抗原，或從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性，還可以對轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行連續(xù)分析，具有蛋白質(zhì)反應(yīng)均一性，固相膜保存時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)。 被廣泛地用于蛋白質(zhì)研究，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。 1 使用劇烈的條件以確保細(xì)胞蛋白能全部裂解下來，但這可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)性的丟失。 2 采用溫和的條件以助于保持蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)，但這造成蛋白質(zhì)從細(xì)胞上的脫落效果欠佳。 機(jī)械破碎細(xì)胞，可釋放

2、出蛋白酶從而使靶蛋白降解。細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白通常比細(xì)胞內(nèi)蛋白具有更好的抵抗力，變性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根據(jù)靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性質(zhì)來調(diào)整提取的條件。 為盡可能減少可能出現(xiàn)的問題，可設(shè)法采用多克隆抗血清或多種單克隆抗體的混合物，因?yàn)樗麄兛膳c某一蛋白的多種形式起反應(yīng)。 溶解方法取決于細(xì)胞的型別和待測抗原的性質(zhì)： 1 表達(dá)靶蛋白的細(xì)菌一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振蕩法或酶法裂解細(xì)胞，然后制備提取液。 3 哺乳動物組織通?？梢詸C(jī)械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。 4 哺乳動物細(xì)胞可用去污劑溫和裂解。如果靶抗原耐受相應(yīng)抽提過程，也可在SDS凝

3、膠加樣緩沖液裂解。用PBS洗兩次細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用橡膠刮子刮下細(xì)胞，由于染色體DNA的釋放，溶液變得很粘稠。吸入1.5ml離心管。超聲打碎染色體DNA,直至溶液不粘為止。4度，13000rpm，30分鐘離心。分成三層：上層為油脂，中層為蛋白質(zhì)，下層為沉淀。有必要時(shí)重復(fù)上一步驟。上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可將上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf -80C保存 細(xì)胞裂解液的量 超聲的頻率，時(shí)間，次數(shù)。插得深不起泡沫。 檢測蛋白的敏感性15ng,0.75mm厚的SDSPAGE的一個孔大約上100ug的總蛋白。 只要被檢測蛋白占總蛋白的1/100000,即可被檢測。 未知蛋白應(yīng)同時(shí)作陽

4、性對照。RIPA（華舜公司）苯甲基磺酰氟PMSF（華舜公司）丙烯酰胺（Amresco公司）雙丙烯酰胺（Amresco公司）麗春紅染料（華舜公司）Tween 20（Amresco公司）過硫酸銨（Sigma公司）四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司）硝酸纖維素膜（Amersham公司）考馬斯亮蘭（Fluka公司）兔抗大鼠Glut 1多克隆抗體（Santa Cruz公司）Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司） 低溫超速離心機(jī)（Eppendorf公司） 分光光度計(jì)（Eppendorf公司） Th

5、ermomixer（Eppendorf公司） 電泳儀（Bio-Rad 公司） 垂直式電泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）10電泳Buffer 稱取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去離子水，定容至1000ml SDS 10克1.5M Tris.HCl PH 8.8 稱取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，調(diào)PH至8.8，定容100ml0.5M Tris.HCl PH6.8 稱取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，調(diào)PH至6.8，定容100ml轉(zhuǎn)膜緩沖液 稱取3.03克Tris.base，14.4克Glyc

6、ine，用ddH2O溶解，定容至800ml，臨用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。30Acry-Bis 29克丙烯酰胺1克雙丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4保存10過硫酸胺，新鮮配制，= 濾紙 膠, 就行，你轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。 電泳時(shí)Marker 按說明加5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎？加入20ul即可。 蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么了

7、？可能是1樣品濃度過低2轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。 一抗量較少，同時(shí)不知道一抗的最佳稀釋比例是多少，怎么做呢？確定實(shí)驗(yàn)過程無污染后，將含抗體的稀釋液回收，保存于-70。最好第一次的濃度做高一點(diǎn)，這樣，如果結(jié)果不好，可以嘗試再稀釋。 可用于檢測并定量分析多種蛋白質(zhì)復(fù)合物中的靶抗原。 很敏感，可檢測出100pg的放射性標(biāo)記蛋白。 當(dāng)與SDS-PAGE并用時(shí)，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)情況。 靶蛋白的放射性標(biāo)記 裂解細(xì)胞 特異性免疫復(fù)合物的形成 免疫復(fù)合物的收集和純化 放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的免疫沉淀分析 同位素通常是35S，其半衰期為87.1天，同位素是以35S標(biāo)記蛋氨酸或35S蛋氨酸和半胱氨酸。 這些氨基酸是哺乳動物細(xì)胞的必須氨基酸，必須由培養(yǎng)基中提供。 培養(yǎng)基中含有高濃度的蛋氨酸和半胱氨酸，為了增加同位素標(biāo)記氨基酸的滲入率，可去除培養(yǎng)基中的蛋氨酸或同時(shí)去除蛋氨酸和半胱氨酸。 同位素標(biāo)記的強(qiáng)度取決于被檢蛋白的合成速度和其氨基酸的組成，以及該蛋白質(zhì)的代謝速度。 用耦聯(lián)葡萄球菌蛋白A和Sepharose進(jìn)行吸附：結(jié)果清晰，但成本高，