NK細胞殺傷活性檢測201375兼[通用]

1、NK細胞殺傷活性檢測 -乳酸脫氫酶釋放法石河子大學醫(yī)學院免疫學教研室2013-7-5目的要求熟悉乳酸脫氫酶釋放法測定NK細胞殺傷活性的檢測方法?！驹怼?乳酸脫氫酶 (LDH) 是活細胞胞漿內(nèi)含酶之一。正常情況下，LDH不能透過細胞膜。當靶細胞受到效應(yīng)細胞的攻擊而損傷時，細胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質(zhì)中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶(NAD+) 變成還原型輔酶(NADH2)。后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽 (PMS) 還原硝基氯化四氮唑藍(NBT)，形成有色的甲臢類化合物，在490nm或570nm波長處有一高吸收峰。利用讀取的A值，經(jīng)過計算即可得知NK細

2、胞殺傷靶細胞的活性。實驗原理 效應(yīng)細胞 靶細胞 釋放LDH 丙酮酸乳酸乳酸脫氫酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT 甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸鹽硝基氯化四氮唑藍【試劑】1. 靶細胞 檢測人的NK 細胞活性常用的靶細胞為體 外傳代細胞株K562。2. 效應(yīng)細胞 從人外周血（肝素抗凝）分離的單個核 細胞。3. 1640 培養(yǎng)液4. LDH 底物溶液（臨用前配制） NBT 硝基氯化四氮唑藍 4mg NAD+I 氧化型輔酶I 10mg PMS 吩嗪二甲酯硫酸鹽 1mg【試劑】 加蒸餾水2ml 溶解，混勻后取上清液1.6ml，加1mol/L 乳酸鈉0.4ml，然后加入0.1mol/L

3、 pH7.4 PBS 至10ml。5. 1% NP40 ： 取1ml NP-40 加去離子水99ml。6. 1mol/L 檸檬酸終止液 取檸檬酸21g 加去離子水100ml實驗步驟效應(yīng)細胞的制備（分離外周血單個核細胞）靶細胞的制備效-靶細胞相互作用酶促反應(yīng)結(jié)果判讀 取培養(yǎng)2448hr的靶細胞(K562), 洗滌3次（1000rpm10min）, 最后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1105/ml, 備用。靶細胞的制備：效應(yīng)細胞的制備（分離外周血單個核細胞）采集靜脈血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分別吸取2ml淋巴細胞分層液置10ml離心管中，將管傾斜4

4、5，沿管壁緩緩注入抗凝血離心2000rpm20min密度梯度離心分離淋巴細胞亞群用完全RPMI-1640定容細胞，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度（加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混勻，1x 107）將所得PBMC用5倍體積的1640洗滌一次2000rpm10 min用毛細吸管輕輕吸去上層的血漿、稀釋液及血小板，再用另一支毛細吸管仔細吸取單個核細胞（灰白色層）計數(shù)PBMC1.計數(shù)4個大方格中（即64個小方格）所有細胞數(shù)2.計數(shù)原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。3.總數(shù)除以4，所得數(shù)據(jù)104即為1ml液體中的細胞總數(shù)4.每ml健康成人血可分離出11062106個單個核細胞 計數(shù)PBMC舉例數(shù)4個大方格細胞

5、數(shù)分別為：87，79，91，85總數(shù)為： 87+79+91+85=342一個大方格的平均數(shù)為：342/4=85.51ml液體中細胞量為：85.5104如果用染液稀釋后計數(shù)，則細胞數(shù)為該數(shù)據(jù)的2倍。效-靶細胞作用 將效應(yīng)細胞和靶細胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔細胞培養(yǎng)板的孔中, 每份標本設(shè)2個復(fù)孔,同時設(shè)靶細胞自然釋放對照組 (0.1ml靶細胞+0.1ml RPMI-1640液)最大釋放對照組 (0.1ml靶細胞+0.1ml1NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37、5CO2溫箱中孵育2-4h。A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 實驗組

6、自然釋放組 最大釋放組 1 2 3 4 5 6 效應(yīng)細胞（100l） + + - - - -靶細胞（100l） + + + + + +RPMI1640 （100l） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + 【操作方法】酶促反應(yīng) ：從37溫箱中取出培養(yǎng)物，吸取各孔上清0.1ml 加于另一培養(yǎng)板孔中。酶促反應(yīng)置37預(yù)溫10min, 加入新鮮配制的底物溶液0.1ml, 37避光反應(yīng)1015min。終止酶促反應(yīng)（用毛細吸管滴一滴1mol/L檸檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12結(jié)果計算 用酶標檢測儀在570nm波長下讀取各孔OD值,

7、 并計算NK細胞活性。實驗組OD值-自然釋放對照組OD值NK細胞活性（%）最大釋放對照組OD值-自然釋放對照組OD值=100%1、無論采用何種試驗方法, 靶細胞的質(zhì)量是影響細 胞標記率、自然釋放率及實驗穩(wěn)定性的重要因 素。一般要求靶細胞的自然釋放率10。2、分離PBMC時，應(yīng)用毛細吸管盡可能吸取灰白 層，切勿攪動各層。3、吸取細胞培養(yǎng)上清時, 應(yīng)盡可能不吸動沉淀的細 胞。4、用此法測得NK活性的正常值范圍在10-40%。注意事項:實驗報告記錄NK細胞殺傷實驗的原理、方法、 結(jié)果。 T淋巴細胞檢查1T細胞檢查（1）T細胞花環(huán)形成試驗 （Erythrocyte rosette formation

8、test, ERFT）E花環(huán)形成試驗（Erythrocyte rosette formation test, ERFT）【目的要求】1.掌握T淋巴細胞E花環(huán)試驗的原理、正常值， 了解其方法和用途。2.熟悉光鏡下E花環(huán)的形態(tài)和計數(shù)方法?！緦嶒炘怼?T細胞表面具有能與綿羊紅細胞（SRBC）表面糖肽結(jié)合的受體，稱為E受體（CD2）。已證實E受體是人類T細胞所特有的表面標志。當T細胞與SRBC混合后，SRBC便粘附于T細胞表面，呈現(xiàn)花環(huán)狀。通過花環(huán)形成檢查T細胞的方法，稱為E花環(huán)形成試驗。根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測知T細胞的數(shù)目，從而間接了解機體細胞免疫功能狀態(tài)，判斷疾病的預(yù)后，考核藥物療效等。 【實驗方法】淋巴細胞與SRBC按一定比例(1:10)混合 37 5分鐘， 420分鐘 取樣涂片瑞氏染色、鏡檢。 計數(shù)E花環(huán)數(shù)，算出總花環(huán)形成率。 正常值為60%80%。 【結(jié)果觀察】高倍鏡檢查：淋巴細胞呈藍色，SRBC呈紅色圍