16SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、用心整理精品16SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1 .適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了通過特定引物對(duì)細(xì)菌的16SrDNAt段進(jìn)行PCFT增，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分 析比對(duì)，快速獲得細(xì)菌種屬信息的操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于未知細(xì)菌的快速種屬分析，以及為細(xì)菌的生化鑒定提供指導(dǎo)信息。2 .方法和原理16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16SrDNAff列測序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組 DNA1取、16SrDNA#異引物PCRT增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNAM序、序列比對(duì)等步驟。是一種快速獲 得細(xì)菌種屬信息的方法。細(xì)菌rRNA （核糖體RNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA 16S rD

2、NA是細(xì) 菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNAff歹1J。16S rDNA由于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn) 不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。在16S rRNA分子中，可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定 區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16S rDNA片段擴(kuò)增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌 進(jìn)行分類鑒定。16SrDNAff歹用前500bp序列變化較大，包含有豐富的細(xì)菌種屬的特異性信息，所以對(duì)于絕大多數(shù)菌株來說，只需要第一對(duì)引物測前 500bp序列即可鑒別出細(xì)菌的菌屬。針對(duì)科學(xué)論文發(fā)表或是 前500

3、bp無法鑒別的情況，需要進(jìn)行16SrDNA勺全序列擴(kuò)增和測序，得到較為全面的 16SrDNA勺序 列信息。由于測序儀一次反應(yīng)最多只能測出 700bp的有效序列，為了結(jié)果的可靠性，通常將16SrDNAir長序列分成3部分進(jìn)行測序。精品用心整理精品16SrDNA27F 二.' 519357F A 1115 <926F.14923對(duì)引物正反向測通后，拼接成 1500bp左右的16SrDNAff列。3 .設(shè)備和材料3.1 器材移液器(1000仙L、200仙L、100仙L、10 L);渦旋振蕩器； Eppendorf MixMate ;離心機(jī)；水浴 鍋；電泳儀；制冰機(jī)；低溫冰箱；PC敬：V

4、eriti 96 Well Thermal Cycler ；凝膠成像儀：VersaDoc MP 400Q 基因分析儀：AB3500 AB31303.2 試劑DNA快速提取試齊1J: PrepMan Ultra ;瓊脂糖；PCRM齊1J: Taq酶，10XTaq Buffer(Mg 2+) , dNTPs ddH2O等；ExoSAP-IT；測序試齊1J： BigDye Terminator , 5X Sequencing Buffer ； BigDye XTerminator Purification Kit ;3.3 耗材移液器吸頭：1000仙 L、200 l L 10/L；離心管：1.5mL

5、、200 l L; Micro AmpMOptical 96-Well Reaction精品用心整理精品Plate ; Micro AmpTM Optical Adhesive Film 3.4引物16SrDN擴(kuò)增長度名稱序列正向弓I 物 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'第1部27F500 bp 左反向弓I 物 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'519R正向引物5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'第2部357F750bp左反向引物5'-AGG GTT

6、GCG CTC GTT GC-3'1115R正向弓I 物 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'第3部926F560 bp 左反向弓I 物 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'1492R其中 M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14.操作流程核酸提一基因擴(kuò)產(chǎn)物測序反LJ序列比5.實(shí)驗(yàn)方法精品用心整理精品5.1 核酸提取：挑取單菌落，然后置于裝有100 n LPrepMan Ultra的離心管中，渦旋震蕩混勻30s左右，然后 100c水

7、浴10min后，以離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心 3min,取10 L上精液與490仙L ddHO（即稀釋50倍）, 混勻作為下步PCR勺模板DNA提取的DNAT-20 C保存。5.2 基因擴(kuò)增5.2.1 PC網(wǎng)應(yīng)體系試齊I使用量（25 口體系）模板DNA2. L ( 10ng100ngTaq酶(5U/ ) L)0.2 p L10X Taq Buffer(Mg 2+)2.5 i LdNTPs各 2.5mM)2 n L引物F(1 m M)5 n L引物R(1 m M)5 n LddHO8.3 p L備注：DNA真板量通常在100 ng以下，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，確定最佳的DNA真板使用量。PC就應(yīng)體系應(yīng)在冰

8、中配置，然后置于冰箱中冷卻 35min,最后放于PCRCZ上進(jìn)行反應(yīng)，這種冷啟 動(dòng)法可增強(qiáng)PCRT增的特異性。5.2.2 PCRS應(yīng)條件94 C： 10min94C: 30s30Cy58C: 30s72C: 45s72C: 5min精品用心整理精品4C : 005.2.3 電泳稱取1g瓊脂糖置于100mLTAE電泳緩沖液中，加熱融化，待溫度降至 60c左右時(shí)，均勻鋪板, 制成1%勺瓊脂糖凝膠。PCRK應(yīng)結(jié)束后，加樣，以100V電壓進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后， 染色，用凝膠成像儀觀察，拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.3 產(chǎn)物純化5.3.1 每5仙LPCRT物力口入2pL ExoSAP-IT試劑，混勻

9、5.3.2 放入 PCRCZ中，37 c 溫育 15min, 80 C 溫育 15min5.3.3 純化后的PCFT物做為下一步測序反應(yīng)的模板。5.4 測序反應(yīng)5.4.1測序反應(yīng)體系試齊I使用量（10口體系）模板DNA1 N L引物(1 m M)1.6 LBigDye Terminator1 N L5X Sequencing Buffer1 N LddHO5.4 n L5.4.2測序反應(yīng)條件96 C : 2min55 C: 15s96C: 30s30Cy精品用心整理精品60 C : 4min4C : 005.4.3 測序反應(yīng)純化(BigDye XTerminator Purification

10、Kit)5.4.3.1 每管加入 27 ii L SAM Solution 和 6pL BigDye XTerminator Solution 。5.4.3.2 放在 Eppendorf MixMate 上 2000rpm 震蕩 30min。5.4.3.3 在離心機(jī)上以1000X g離心2min。5.4.3.4 每管吸取10pL上精液于96孔板中，放入測序儀中測序。5.5 序列比對(duì)基因測序儀得到的測序結(jié)果，在 MicroSEQ微生物鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行比對(duì)，得到菌種的種屬信息。6.關(guān)鍵說明6.1 提取細(xì)菌基因組 DNA時(shí)，對(duì)于細(xì)胞壁比較薄的革蘭氏陰性細(xì)菌，可挑取一菌環(huán)菌株，置于 100ddWO中，混

11、勻，沸水熱變性10min后，離心3min分離，稀釋50倍后彳故為PCR模板。必要時(shí)做梯度PCR!認(rèn)最佳的模板量。6.2 PC亞測序反應(yīng)時(shí)，為了保證酶的活性，整個(gè)體系應(yīng)在冰中配置；然后置于低溫冰箱中冷卻 35min,最后放于PCRZ上進(jìn)行反應(yīng)，這種冷啟動(dòng)法可增強(qiáng)PCRT增的特異性。6.3 16SrDNAff列白前500bp序列變化較大，包含有豐富的細(xì)菌種屬的特異性信息，所以對(duì)于絕大多數(shù)菌株來說，只需要第一對(duì)引物測前 500bp序列即可鑒別出細(xì)菌的菌屬。針對(duì)科學(xué)論 文發(fā)表或是前500bp無法鑒別的情況，需要進(jìn)行16SrDNA勺全序列擴(kuò)增和測序，得到較為 全面的16SrDNA勺序列信息。具體參照附錄

12、。PCR*現(xiàn)非特異性條帶的原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、謔火溫度過低，及 PCR1環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶 精品用心整理精品易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有: 必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán) 次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93 C變性，65c左右退火與延伸）。PCRT增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+ft度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多

13、引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2< 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。用RT陰性對(duì)照檢測是否被基因組 DNA虧染模板濃度過高10ul 體系 100ngDNA精品用心整理精品附錄（資料性附錄）1.細(xì)菌16SrDNA三部分的PCR吉果電泳圖M 1232000b1000b750bp500bp250bp100bpMt DL200Q1:弓I物27F和519R的PC*物（第1部分500bp）2:弓|物357F和1115R的PC*物（第2部分750bp）3:弓I物926F和1492R的PC*物（第3部分560bp）精品用心整理精品2.細(xì)菌16SrDNA定結(jié)果

14、2.1 16SrDNMl 500bp即可反映細(xì)菌的種屬信息:菌株TL140924的鑒定結(jié)果SpecimenLibraryLibrary EntryName% MatchConcensus LengthLibrary EntryLengthTotalMl$rTiatGh«$TL140924AB Bacterial3一00Lib_2.2Aarofnonas veronll iATCC=35624100.04924910TL140924A6_Bacttjfial5001.2一2Jandaei iATCC=4956a)93.94926TL14O924A® Bact/iH5OOLib

15、_2.2Aeromonas vwnonii1 (CECT-419G)98.774924917TL140924AB Bacterial 5OOLib_2.2Aernmonss schubeii (ATCC=437OO )98754924916TL14Q924A6_BanterialSOOLfo_2.2Aer<xnona$ sobriw -ATCCM3979 )07.7249249112精品用心整理精品2.2 16SrDNMf 500bp不足以反映細(xì)菌的種屬信息:菌株70528的鑒定結(jié)果SpeameoLfcraryLtrary Eng Hinn e% kiatdiCense r»S

16、USLtjfiyLliLibrar y Ei舟f Lewi hTobiKtisinaidi70523AE BaclenalMOLbJ 2SfrTKXiela enteric enienca* (ATCC=13312)曲82J57弼270528AB Eac1efiai50(U)_2Sakntxiefc ent?rfca 國誦icT (AT(X=13076tt12枚489270520AB_Bac1erial50(lly_22和 knor 曲 enterta 畫 erica.Rraxiwao99脫卅蝴270529AB_eaclerial500Lt)_2JSalirioneti eiii a enle

17、rica* (ATCC±HG2B99824574892WB同CE3叫99.8245749922.3 16SrDNA勺全序列信息:菌株70528的鑒定結(jié)果Specvnenl酎ayUtrsr'； Entr： Kam三%Mri： hConst n5USLengthLibrar y ErilLg hTold hfsmaic hes7M2BAB BaGtenalFulGard.t 2.0SaJmcnella enlerica enleiMs (ATGC= 13076)弱的1467i檄II7062ftAB.BactejialRilGerfeLt _2,0Umm 削 a enterica h'pTimunum ATDC= 14028)泡71146767加加AB_Bacte;iali-ui jerieLt