常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程

1、常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-00起 草 人起草日期 年 月 日復(fù)制份數(shù)2份審 核 人審核日期 年 月 日頒發(fā)部門質(zhì)量管理部批 準 人批準日期 年 月 日生效日期年 月 日分發(fā)部門質(zhì)量管理部、質(zhì)控室編訂依據(jù)實用中藥藥品檢驗檢測技術(shù)指南目的：規(guī)范液相色譜柱的使用與管理；液相色譜柱標準化老化與再生；剖析液相色譜柱常見問題與解決辦法。延長色譜柱使用壽命，降低色譜柱使用成本。提高分析人員液相色譜柱使用與維護水平。范圍：適用于使用高效液相色譜儀的儀器分析操作人員及相關(guān)管理人員。責任：設(shè)備員、液相操作人

2、員、質(zhì)控主管、質(zhì)量管理部經(jīng)理、質(zhì)量受權(quán)人。內(nèi) 容：1.定義 液相色譜柱：指用于液相色譜分離的柱形固定相，由柱管、壓帽/卡套、篩板（濾片）、填料、接頭等組合而成，可用于液相色譜分析與制備。 色譜柱再生：指色譜柱在非正常情況下，針對異常現(xiàn)象及原因采取的一系列修復(fù)補救措施，以提高色譜柱柱效和延長其使用壽命的處理過程。 運載溶劑：指色譜柱生產(chǎn)廠商在柱出廠測試合格后飽和于色譜柱內(nèi)的合適溶劑，以利于運輸保存，多與保存溶劑相同。 保存條件：指色譜柱生產(chǎn)廠商根據(jù)不同柱類型及其色譜柱填料的制備、鍵合、裝填、高壓定型、凈化干燥等工藝條件的不同要求而特別制定的色譜柱保存前凈化飽和的處理程序與儲存條件，包括凈化程序、

3、凈化溶劑和保存溶劑、保存條件。 保存溶劑：用于保存色譜柱并指定了溶劑組成與比例的溶液。 反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等。常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱，常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基柱（-NH2）：可以同時用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時需注意，正相反相交替使用時必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動相互溶。氨基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑，例如：正己烷-乙腈（99：1）。2.液相

4、色譜柱的使用及保養(yǎng)文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-00普通C8及C8反相色譜柱的老化處理與使用保養(yǎng)程序新購色譜柱出廠前均采用適合的運載溶劑飽和，密封，由于運輸過程周期較長，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新飽和與老化。若老化方法不正確或時間不夠，極易導(dǎo)致色譜柱在使用較短時間后即產(chǎn)生分離度下降、峰形變差、峰拖尾等柱效降低的情況。需根據(jù)色譜柱不同類型選擇不同飽和與老化方法。老化老化前準備：準備新鮮的超純水及色譜級乙腈或甲醇，沖洗色譜儀器系統(tǒng)，保證儀器系統(tǒng)管路干凈。將色譜柱反向連接，不接檢測器。用水-有機相（90：1095:5），以minmi

5、n流速沖洗20min30min（目的是沖洗出柱入口端無機雜物與篩板孔雜物，使篩板正常）。再將色譜柱正向連接，不接檢測器。用水-有機相（90：1095:5），以minmin流速沖洗20min30min（目的是沖洗出柱出口端無機雜物與篩板孔雜物，使篩板正常）。連接檢測器，開啟柱溫達3040，用水-有機相（90：1095:5），以minmin流速沖洗4h以上（目的是充飽和色譜柱，去除柱內(nèi)空氣）。老化色譜柱：用水-有機相（10：905:95），以minmin流速沖洗2h以上或在120min內(nèi)以水-有機相（95:50:100）梯度變化，以minmin流速沖洗；再用100%有機溶劑，以minmin流速沖洗

6、1h以上；最后用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗1h以上（不同品牌色譜柱需區(qū)別對待）。 使用相平衡過渡:根據(jù)水相-有機相的比例，首先調(diào)整水-有機相的比例接近流動相水相-有機相的比例，以1ml/min流速沖洗30min左右；如果流動相中含有緩沖鹽，決不可在柱老化后立即用流動相平衡，必需先用90%以上水進行預(yù)平衡30min以上，否則，會導(dǎo)致緩沖鹽在柱內(nèi)析出結(jié)晶，嚴重時會將新柱永久不可逆地損壞。然后更換成新制并經(jīng)m濾膜過濾，超聲脫氣后的流動相，按檢測方法平衡至少1h，待基線穩(wěn)定后，開始進樣檢測。維護與保養(yǎng)新柱首次使用，在進樣完成后需立即對色譜柱進行凈化和有機溶劑飽和。方法是：用水-有機相（

7、90：1095:5），以min流速沖洗1h以上；再用水-有機相（90：1095:5），以1ml/min流速沖洗30min以上。（或者采用溶劑梯度變化至100%有機相沖洗120min以上）；最后用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗1h以上；若流動相中有緩沖鹽，建議用100%水沖洗1h以上后，再重復(fù)上述凈化程序（但個別品牌C8或C18色譜柱不耐受純水沖洗者例外）。新色譜柱使用幾次，均正常后，運行完畢凈化處理程序可簡化為：用水-有機相（90：文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-001095:5），以1ml/min流速沖洗1h以上；再用10

8、0%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗30min以上。當供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進樣后，由于表面活性劑會在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接，不接檢測器，用水-乙腈（90：1095:5），以min流速沖洗2h以上；再用100%乙腈，以min流速沖洗1h以上，然后正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：1095:5），以1ml/min流速沖洗1h以上；再用100%乙腈，以1ml/min流速沖洗1h以上，即可恢復(fù)。凈化完畢，若次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑沖洗10倍柱體積以上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱

9、管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。若色譜柱使用后入庫保存，長時間未使用，重新使用時仍需重新飽和。方法是：用水-有機相（90：1095:5），以min流速沖洗1h以上；再用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗30min以上；然后調(diào)整水-有機相的比例接近流動相水相-有機相的比例，以1ml/min流速沖洗30min左右；最后用流動相平衡1h以上，進樣檢測。必需注意流動相pH值不能超過色譜柱pH耐受范圍，過酸容易使鍵合相變態(tài)，過堿則易導(dǎo)致硅膠溶解柱床塌陷。常見故障處理與色譜柱再生當色譜柱使用較長時間之后，就可能發(fā)生柱壓升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等情況，這時就需要根據(jù)故障原因?qū)ιV柱進

10、行清堵與再生，以延長色譜柱的使用壽命。具體原因及處理方法如下： 篩板堵塞與柱頭塌陷：主要現(xiàn)象有柱壓嚴重升高或不穩(wěn)定、色譜峰拖尾、色譜峰變寬、色譜峰分叉、禿峰等，需要進行清堵與彈性復(fù)原處理。（此方法適合于任何類型有相同故障的色譜柱的處理，不同的是溶劑要與相應(yīng)類型色譜柱匹配。）主要處理方法如下：.1一般情況下，將色譜柱反接，不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以min流速沖洗約4h；再正向連接，接或不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以min流速沖洗約1h；再提高流速至min沖洗1h，觀察柱壓變化。若不湊效，則擰開柱頭螺母（色譜柱進口），小心取下篩板

11、，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20min左右，再用純水超聲20min左右。用小勺清理掉柱進口污染的部分填料，再將用乙醇調(diào)和后的相應(yīng)的硅膠裝入柱入口（也可用已經(jīng)報廢的同類柱中的填料替代），用平面不銹鋼小鏟壓緊填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否則，壓得太緊柱壓會升高，然后裝上清洗過的篩板，注意篩板安裝方向必需與原裝相同，最后緊固。.2沖洗與飽和：清堵緊固后，先反向連接色譜柱，不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以min流速沖洗約4h；再換成甲醇以min流速沖洗約2h；再正向連接色譜柱，接或不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以min流速沖洗約2h；

12、再換成甲醇以min流速沖洗約1h；然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速沖洗約文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-001h以上，再根據(jù)測試用流動相比例調(diào)整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速沖洗約1h；最后用測試用流動相平衡2h，進樣測試即可。.3特殊說明：如不是特殊情況，按其他辦法可行，則最好不要反沖色譜柱和拆卸篩板。柱效降低：主要特征性現(xiàn)象有柱壓基本正常，但出現(xiàn)拖尾峰、禿峰、分叉峰、前延峰、峰變寬、基線漂移、理論板數(shù)降低、分離度降低等。需要進行再生處理，具體方法如下：.1一般情況下，順接色譜柱，按如下溶劑順序及條件沖洗：95%水-

13、5%甲醇（或乙腈）（min，1h以上）；100甲醇（min，1h以上）；100乙晴（min，1h以上）；75乙晴-25異丙醇（min，10倍柱體積以上）；100異丙醇（min，10倍柱體積以上）；100二氯甲烷（min，10倍柱體積以上）；100正己烷（min，10倍柱體積以上，根據(jù)實際情況可忽略）；100%異丙醇（min，20倍柱體積以上）；95%水-5%甲醇（或乙腈）（min，30min；再升至min，10倍柱體積以上）；檢測用流動相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進樣測試。在沖洗過程中，隨時關(guān)注柱壓變化，確保不超過4000psi；若超出，可通過降低流速，升高柱溫來調(diào)整。.2若上述方法效果不理想，可

14、按如上溶劑順序和條件，先反接色譜柱沖洗；再順接色譜柱，用100%乙腈以1ml/min流速沖洗約2h；再用與流動相同比例的水-有機相以1ml/min流速沖洗約30min；最后用流動相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進樣測試即可。.3特別說明：再生過程必須隨時關(guān)注柱壓變化，柱壓過高易導(dǎo)致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時要保證再生時間足夠。當分析復(fù)雜樣品時間過長，尤其是中藥分析，若出現(xiàn)柱壓正常而色譜峰形變差，分離度降低時可嘗試如下方法再生.1 先用5%甲醇（或乙腈）-95%水，將色譜柱反向連接，以1ml/min沖洗60min以上；再用四氫呋喃（或丙酮）以min沖洗60min以上（去除脂類）；再用

15、65%甲醇（或乙腈）-35%水，以流速1ml/min沖洗60min；然后用純甲醇或乙腈沖洗30min；接著用與流動相同比例的水；有機相以1ml/min流速沖洗約30min；最后用流動相平衡2h，進樣測試即可。.2 特別提醒：再生時最好選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統(tǒng)色譜儀器進行，以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。.3 警告：無論何時，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流動相長時間（30min以上）走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至導(dǎo)致柱床局部塌陷或中部開裂。使用與保存時，嚴禁用力甩，絕對杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否

16、則，易導(dǎo)致柱床機械性損壞，則再無再生可能。 正相色譜柱的老化處理與使用保養(yǎng)程序新購氨基柱老化處理及使用基本程序如下：文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-00若在正相條件下使用：.1老化用正己烷-乙腈（99：1）以min的流速沖洗約50倍柱體積。.2使用.根據(jù)待分析用正相流動相極性選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速沖洗約10倍柱體積。.用正相流動相平衡1h以上，確保柱壓控制在6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進樣檢測。如果要使用的流動相中含有緩沖鹽類，在使用流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約10倍柱

17、體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。.3維護與保養(yǎng).分析完畢，用異丙醇，以min流速沖洗色譜柱約30倍柱體積；再用甲醇，以1ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積；再用異丙醇，以min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積。若使用的分析用流動相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動相沖洗約30倍柱體積，再按上述方法沖洗。.凈化完畢，若次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑一般用正己烷-乙腈（99：1）沖洗10倍柱體積以上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。.重新在正相條件下使用時，重復(fù)上述過程即可，時間可適當減少一半左右。.4常見故障處理與

18、色譜柱再生.在正相條件下使用時，故障率較低。但要注意不可進樣含有醛基、羰基的化合物，不可用于還原糖的分析；流動相要徹底脫氣，并不得含有羰基化合物和過氧化物（質(zhì)量較差的乙醚、四氫呋喃等溶劑中含有少量）。任何時候更換流動相時都要確保新流動相與柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用異丙醇過渡。.當使用氨基柱進行酸性物質(zhì)分析時，酸性物質(zhì)溶液有質(zhì)子存在，會使略帶負電荷的氨基官能團質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時間后被測成分保留性質(zhì)有所改變或柱效下降。這時，建議按如下方法處理：首先用異丙醇，以min流速，沖洗約50倍柱體積；然后用甲醇，以min流速，沖洗約50倍柱體積；再用異丙醇，以min流速，沖洗約10倍柱體積過渡

19、，回到平常使用的正相流動相平衡2h，進樣檢測即可。.若上述方法不湊效，可嘗試按以下程序沖洗與再生：首先用含%NH3的50%乙腈-50%水溶液，以min流速沖洗該柱約510倍柱體文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-00積；然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以min流速沖洗該柱約510倍柱體積以洗去多余NH3；再用添加少許NH3（如）的酸性分析物的流動相平衡2h左右，進樣檢測即可。在反相條件下使用：操作和維護與C18柱基本相同，但需注意，沖洗溶劑中有機相不能低于10%。.1老化用正己烷-乙腈（99：1）以min的流速沖洗約30倍柱體積

20、。.2使用依次以min的流速，用等量的氯仿異丙醇甲醇甲醇-水（50：50）分別沖洗柱子約10倍柱體積；再以min的流速，用以下的氫氧化鈉溶液沖洗柱子約30倍柱體積（注意：pH值切不可超過）；立即用水以min的流速沖洗柱子約30倍柱體積；最后換成反相流動相平衡1h以上，待基線平穩(wěn)，進樣檢測。（備注：若要使用的反相流動相中含有緩沖鹽類，在用反相流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時，要特別注意控制pH值范圍及流動相中水的比例，pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。最理想的pH范圍在pH ，

21、決不允許超過。）.3維護與保養(yǎng).反相條件下使用完畢，凈化處理程序同C18柱,但需注意，沖洗溶劑中有機相不能低于10%。.凈化完畢，先用甲醇以min的流速沖洗柱子約10倍柱體積；然后用異丙醇以min的流速沖洗柱子約10倍柱體積；最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑一般用正己烷-乙腈（99：1）以1ml/min沖洗約10倍柱體積。若次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑沖洗10倍柱體積以上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。.4常見故障處理與色譜柱再生在反相條件下使用時，-NH2鍵會水解，尤其是在該柱子pH范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會

22、下降很快，所以故障率較高。若出現(xiàn)柱壓增高柱效降低等情況，建議采用如下方法處理：.若流動相含有緩沖鹽，先以流動相比例的水-有機溶劑，以檢測分析時同流速沖洗約30倍柱體積；再用純甲醇，以min流速沖洗約50倍柱體積；然后用異丙醇，以min流速沖洗約10倍柱體積過渡；再用二氯甲烷以min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積；再用異丙醇以min流速沖洗約10倍柱體積過渡回到甲醇條件下，以min流速沖洗約10倍柱體積，密封保存或用流動相平衡2h左右（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本

23、號SOP-QC-000-00.若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：95水-5乙腈，以min流速沖洗約10倍柱體積；THF（四氫呋喃），以min流速沖洗約10倍柱體積；95乙腈-5水以min流速沖洗約10倍柱體積；保持95乙腈-5水，以低流速沖洗過夜；流動相平衡2h（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。.親水性色譜柱親水性色譜是正相色譜的一個變種。HILIC HPLC Column親水性色譜柱是以超純硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有二氧化硅(silica，弱酸性)，氰基（cyano，弱酸性）,二羥基（diol，中性），二丙基乙酰胺基（v

24、alpromide，弱堿性），丙基酰胺基（Venusil，弱堿性），氨基（amino，弱堿性）,吡啶基（Pyridine，弱堿性），咪唑基（Imidazole，弱堿性）等親水基團的極性固定相。可用于正相、反相和親水液相色譜，是代替氨基柱和硅膠柱的最佳選擇。與傳統(tǒng)硅膠柱相比，具有更好的重現(xiàn)性和柱壽命。HILIC HPLC Column親水性色譜柱分離機理目前還存在著爭議，主要包括以下三個方面：分配機理、離子交換、偶極-偶極相互作用。而更多的試驗現(xiàn)象則表明HILIC的保留機理包含氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級效應(yīng)，很難將其區(qū)分開來。HILIC HPLC Column親水性色譜柱適合于分離在

25、反相色譜柱上不保留的極性化合物，尤其是對強極性堿性化合物的保留能力強，因此，其成為研究藥物代謝、藥物發(fā)現(xiàn)和組合化學(xué)科學(xué)的首選，尤其適用于LC-MS及LC-ELSD。通常主要用于分離水溶性極強的極性化合物，如有機酸（eg.水楊酸）、糖類等。其檢測靈敏度可比使用反相色譜柱提高101000倍。其使用與保養(yǎng)基本同正相色譜柱。老化采用水-乙腈（50:50）以min流速，沖洗至少50倍柱體積進行一次預(yù)平衡；再用水-乙腈（30:70）以檢測條件流速，沖洗約10倍柱體積進行二次預(yù)平衡。 使用用初始流動相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積進行初始平衡；然后進樣1至2針，進行進樣平衡；再用初始流動相條件按檢測方法沖

26、洗約20倍柱體積，進行最終平衡；進樣檢測。維護與保養(yǎng)分析完畢后，首先用水-乙腈 (90:10) 以min流速，沖洗約30倍柱體積（洗出強極性物質(zhì)）；再用水-乙腈（50:50）以min流速，沖洗至少50倍柱體積（洗出中等極性物質(zhì)）；再用水-乙腈（10:90）以min流速，沖洗至少30倍柱體積（洗出弱極性物質(zhì)及飽和色譜柱）；若次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑沖洗10倍柱體積以文件題目常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標準操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-00上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。（保存溶劑多為90%乙腈溶液，多保存于10左右環(huán)境中）。特別注意：.1進樣檢測時，必需要保證流動相中至少含有40%左右的有機相（以乙腈多用）。流動相中若需使用添加劑時，一般避免添加離子對試劑，推薦使用醋酸