細(xì)胞生物學(xué)實驗教案 (1)

1、實驗一 特殊光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)與使用【實驗安排】 3學(xué)時 教師講解演示，學(xué)生操作【目的要求】1、掌握暗視野顯微鏡、相差顯微鏡和熒光顯微鏡的特殊部件；2、掌握暗視野、相差和熒光顯微鏡的工作原理和使用方法；3、熟悉暗視野顯微鏡、相差顯微鏡和熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)。【實驗用品】特殊顯微鏡、酵母、牙垢微生物、菠菜、離心機(jī)、勻漿機(jī)【實驗內(nèi)容】   1、特殊光學(xué)顯微鏡特殊部件的構(gòu)造及調(diào)節(jié)2、特殊光學(xué)顯微鏡的使用及注意事項一、暗視野顯微鏡：【實驗原理及使用】、特殊部件：暗視野聚光器使光源的中央光束被阻擋不能由下而上地通過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反

2、射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個視野是黑暗的。暗視野顯微鏡工作原理示意圖2、用途：暗視野顯微鏡常用來觀察未染色的透明樣品。這些樣品因為具有和周圍環(huán)境相似的折射率，不易在一般明視野之下看的清楚，于是利用暗視野提高樣品本身與背景之間的對比。這種顯微鏡能見到小至4200nm的微粒子，只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。3、使用方法：（1）從聚光器座架上卸下明視場聚光器，換裝暗視場聚光器，安裝到位并固緊。（2）把被檢樣品的玻片標(biāo)本置于載物臺上，需用油浸的暗視場聚光器，要在聚光器上透鏡與載片間滴加香柏油，使之密接。（3）聚光器光軸的調(diào)中。聚光器的光軸要與顯微鏡的光軸位于同一軸線上。

3、其方法是，用低倍物鏡對樣品聚焦，隨之用聚光器升降螺旋上下調(diào)節(jié)聚光器位置，當(dāng)在暗視場中清晰地窺見一光環(huán)或圓形光點時，停止升降聚光器，用聚光器調(diào)中桿推動聚光器，使視場中的光環(huán)或光點，調(diào)至視場中心位置。（4）調(diào)節(jié)聚光器焦點，使之位于被校樣品處，轉(zhuǎn)動聚光器升降螺旋，使視場中光環(huán)調(diào)成一最小的圓形光點，此刻即為聚光器的焦點恰于樣品處。（5）更換需用的高倍物鏡進(jìn)行鏡檢觀察。4、注意事項：（1）聚光器與物鏡的數(shù)值孔徑應(yīng)合理匹配，物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑；否則會因物鏡孔徑角大于暗視場聚光器所形成的照明光束中心暗區(qū)的角度，致使部分照明光線射入物鏡，破壞或降低了暗視場的照明。（2）使用高數(shù)值孔徑的油浸

4、暗視場聚光器時，在聚光器與載片之間要滴加香柏油進(jìn)行油浸，使兩者密接。否則，照明光線于聚光器的上透鏡表面進(jìn)行全反射，照明光線照射不到被檢樣品，呈現(xiàn)不出暗視場照明的效果。（3）載片厚度要適宜，照明光束經(jīng)暗視場聚光器后，產(chǎn)生空心照明光錐，即中心為暗區(qū)，而反射光的焦點在聚光器上透鏡表面之上很短的距離，因此，載玻片的適宜厚度應(yīng)在0.8一1.2mm。（4）載玻片和蓋片應(yīng)清潔無傷痕，否則照明光線會于其處發(fā)生漫反射而影響暗視場的照明。（5）照明光源的照明強(qiáng)度要高。因暗視場照明是通過反射光照亮被檢樣品，若照明強(qiáng)度過弱照明樣品的反射光強(qiáng)度不夠，會影響觀察效果，目前多應(yīng)用高功率的溴鎢燈作為照明光源以提高其照明強(qiáng)度。

5、二、相差顯微鏡：1、原理：在顯微鏡下鏡檢時，視場內(nèi)的樣品只有在反射光的波長(顏色)和振幅(亮度)與周圍介質(zhì)有變化時，方能窺見被檢樣品?；畹臉悠范酁闊o色透明，照明光線通過這種物體時，透過或反射光的波長和振幅都不發(fā)生改變，所以用普通光學(xué)顯微鏡難以辨清活體的結(jié)構(gòu)。必須借助于固定和染色等理化方法，使樣品和背景的反射或透射光在波長和振幅上發(fā)生變化即在顏色和亮度上有所差異，以供識別。相差方法法應(yīng)用于生物學(xué)的主要價值，在于它能對透明的活體進(jìn)行直接觀察，無需采用使細(xì)胞致死的固定和染色的方法。染色給活體以有害的影響，甚于失真。因此才使相差法顯得異常重要。相差是指同光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差

6、異。相位是指在某時間上光的波動所達(dá)到的位置。一般由于被檢物體（如不染色的細(xì)胞）所能產(chǎn)生的相差的差別太小，我們的眼睛是很難分辨這種差別的。只有當(dāng)變相差為振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。用肉眼看不到的相差只要利用衍射和干涉現(xiàn)象把相差變?yōu)槊靼档恼穹睿涂赡芸吹健Ｏ嗖铒@微鏡就是利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。相差顯微鏡利用光的衍射和干涉特性，在普通光學(xué)顯微鏡中增加了二個部件；在聚光鏡上加了一個環(huán)狀光闌，在物鏡的后焦面加了一個相板，從而使看不到的相位差變成以明暗表示的振幅差。因此，可以用來觀察無色透明活細(xì)胞中的細(xì)節(jié)。為了達(dá)到相差效應(yīng)，在相差顯微鏡的物鏡中，裝有由光學(xué)玻璃制成的相板，在圓形相板的平面

7、上有一圈與周圍(里外)相板厚度不同的或凸或凹的圓環(huán)。相板分兩部分；（1）共軛面：通常為環(huán)狀，是通過直射光的部分。其環(huán)是凸起的，也可能是凹陷的。(2)補償面(comPIemQtagy are3)：共軛面內(nèi)外兩側(cè)部分，是通過衍射光的部分。在相板的共扼面或補償面上，涂有改變光波相位或吸收光線的物質(zhì)。當(dāng)光線通過時，使光波的相位或振幅改變從而達(dá)到不同的目的與觀察效果。利用相板把光波相位推遲，振幅改變。相板的作用，除推遲直射光和衍射光的相位之外，還有吸收光，從而使亮度改變的作用。物鏡的后焦點位于透鏡中間而相板位于物鏡的后焦面上，所以，相板也安裝在透鏡中間。在后焦面上裝有種類不同的相板的物鏡稱為相差物鏡。2

8、、相差顯微鏡特殊附件：相差物鏡、帶環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾色鏡。（1）相差物鏡： 相差物鏡是顯微鏡特有重要裝置。相位板涂有氟化鎂，可將直射光或衍射光相位推遲1/4。A+相板：將直射光推遲1/4，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。 明反差或負(fù)反差：是指在相差顯微鏡的視場中，物像亮度大于背景亮度的現(xiàn)象。在被檢物體的折射率大于媒質(zhì)時，直射光被相板的共軛面上涂有改變相位和吸收光線的物質(zhì))推遲14波長，同時吸收80一90，振幅變小，致使僅由直射光照射的背景變暗。通過補償面的衍射光沒有變化，由于直射光推遲l4波長，兩者(直射光與衍射

9、光)有完全相同的相位，合成波P等于直射光s與衍射光D之合，即Ps十D，故振幅加大。物像是這兩種波的合成波造成，即物像等于P。所以比只有直射光照射的背景亮得多。B+相板：將衍射光推遲1/4，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗，形成暗反差（或稱正反差）。暗反差或正反差是指在相差顯微鏡的視場中，背景亮度大于物像亮度的現(xiàn)象。與明反差相反，把通過補償面(因為在相板的補償面上涂有改變光波相位的物質(zhì))的衍射光推遲14波長，使衍射光與直射光的相位相差12波長，同時，直射光在共軛面(上涂吸光物質(zhì))被部分吸收。由于兩者在像點相互干涉的結(jié)果，使合成波(PsD)振幅變小，被檢物像的影像比背景顯著

10、變暗。根據(jù)上述原理所制成的顯微鏡便是相差顯微鏡，聚光鏡下面設(shè)有環(huán)狀光闌物鏡后焦面裝有相板。（2）帶環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器：位于鏡臺之下。普通聚光器的所在位置上由聚光鏡和環(huán)狀光闌構(gòu)成。環(huán)狀光闌位于聚光鏡之下，是一種特殊的光闌裝置，由大小不同的環(huán)狀通光孔構(gòu)成，不同規(guī)格的通光孔環(huán)狀光闌裝配在一個可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，按需要調(diào)轉(zhuǎn)使用。環(huán)狀光闡的環(huán)寬與直徑各不相同，與不同放大率的相差物鏡內(nèi)的相板相匹配，不可濫用。轉(zhuǎn)換前端朝向使用者一面有標(biāo)示窗(孔)，轉(zhuǎn)盤上的不同部位標(biāo)有0、l、2、3和4或0、10、20、40和100字樣，通過標(biāo)示窗顯現(xiàn)?！?”表示非相差的明視場的普通光闌。1或10、2或20、3或40、4或l0

11、0，表示與相應(yīng)放大率的相差物鏡相匹配的不同規(guī)格的環(huán)狀光闌的標(biāo)志。通過手動轉(zhuǎn)入標(biāo)示窗內(nèi)之?dāng)?shù)字表示該數(shù)字所代表的環(huán)狀光闌已進(jìn)入光路。（3）合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡：合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡簡稱CT，又名合鈾調(diào)中目鏡。它是眼透鏡，可行升降調(diào)節(jié)，具有較長焦距的一種望遠(yuǎn)目鏡。鏡筒較長，其直徑與觀察目鏡相同。它的功用僅作為環(huán)狀光闌的環(huán)孔(亮環(huán))與相差物鏡相板的共扼面環(huán)孔(暗環(huán))的調(diào)中合軸與調(diào)焦之用。相差顯微鏡使用時，轉(zhuǎn)盤聚光器的環(huán)狀光闌與相差物鏡必須匹配，且環(huán)狀光闌的環(huán)孔與相差物鏡相板共扼面的環(huán)孔在光路中要準(zhǔn)確合軸，并完全吻合或重疊。以保證直射光和衍射光各行其路，使成像光線的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷恼穹睢５?，鏡體的光路中前述兩

12、環(huán)的影像較小、一般目鏡難以辨清，不能進(jìn)行調(diào)焦與合軸的操作，需借助合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡。（4）綠色濾色鏡：相差物鏡的種類，從色差消除情況來分，多屬消色差物鏡或PL物鏡，消色差物鏡最佳清晰范圍的光譜區(qū)為510-630nm。欲提高相差顯微鏡的性能最好以波長范圍小的單色光照明，即接物鏡最佳清晰范圍的波長的光線進(jìn)行照明。所以，使用相差物鏡時在光路上加用透射光線波長為500一600nm左右的綠色濾色鏡使照明光線中的紅光和藍(lán)光被吸收。只放過綠光，可提高物鏡的分辨能力。該濾色鏡兼有吸熱的作用，以利活體觀察。3、使用方法：（1） 打開光源（2） 在明視野下對光、調(diào)焦。觀察透明標(biāo)本時要縮小光闌。（3） 旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤聚光器，

13、使環(huán)狀光闌直徑和孔寬和所使用的相差物鏡相匹配，并充分開大虹彩光圈。（4） 合軸調(diào)中：拔出一目鏡，換上合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡，用左手固定其外筒，一邊看望遠(yuǎn)鏡，一邊用右手升降內(nèi)筒調(diào)焦，準(zhǔn)焦時即可看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可固定望遠(yuǎn)鏡。升降聚光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，再左右前后調(diào)節(jié)光闌的側(cè)邊，使亮環(huán)和暗環(huán)完全重合。（5） 取下望遠(yuǎn)鏡，換上目鏡，即可進(jìn)行觀察。4、注意事項：（1）載物片必須平整、均勻；標(biāo)本不能太厚，否則相差顯微鏡成像效果不好。（2）標(biāo)本在有水的環(huán)境中，要用水封片等，成像效果明顯。（3）載物片表面要干凈，否則觀察的視野中顯示許多小的圓斑，影響觀察效果。（4）光路上最好

14、加單色濾光片，在此單色光下，相差顯微鏡的分辨力最高。（6） 注意當(dāng)換不同倍率的物鏡時，都要選用相一致的相板和相環(huán)，并重新調(diào)中。否則，相差顯微鏡成像效果不佳。三、熒光顯微鏡1、實驗原理：熒光顯微鏡是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本產(chǎn)生不同顏色的熒光，再通過物鏡和目鏡的放大作用來顯示標(biāo)本中的某些化學(xué)成分和細(xì)胞組分的顯微裝置。某些物質(zhì)經(jīng)波長較短的光線照射后，分子被激活，吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量部分轉(zhuǎn)化為熱能或用于光化學(xué)反應(yīng)外相當(dāng)一部分則以波長較長的光能形式輻射出來，這種波長長于激發(fā)光的可見光稱作熒光。某些物質(zhì)受紫外線照射時可發(fā)出熒光，這種物質(zhì)稱熒光物質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)含有少數(shù)天然熒光物質(zhì)，如維生素、脂褐素、核黃素

15、等經(jīng)紫外線照射后可自發(fā)熒光。還有些細(xì)胞成分雖然受照射后不發(fā)熒光，但可以與某些熒光物質(zhì)，如酸性品紅、甲基綠、丫叮橙等結(jié)合，經(jīng)紫外線照射后可誘發(fā)出熒光。熒光顯微鏡就是根據(jù)這一現(xiàn)象而設(shè)計的顯微放大裝置，可以觀察到這些熒光物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布位置。2、熒光顯微鏡的基本裝置( 1 )光源：采用高壓汞燈。汞燈能以最小的表面發(fā)出最大數(shù)量的紫外光和藍(lán)光，且光亮度大，光度穩(wěn)定。(2)濾色鏡系統(tǒng)：按用途或功能，主要分為下列兩類；激發(fā)濾色鏡：激發(fā)濾色鏡的作用，在于為被檢樣品的熒光染料提供最佳波段的激發(fā)光。熒光染料均有一定的吸收光譜(激發(fā)峰值)，利用濾色鏡對光線選擇吸收的能力選用其透射光譜。恰為熒光染料的最大吸收光譜(

16、激發(fā)高峰)的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜光波中選擇透過最宜波段的光線供使用。激發(fā)濾色鏡加放于汞燈和二向色鏡之間，物鏡之前。阻斷濾色鏡：阻斷濾色鏡位于物鏡之上，二向色鏡和目鏡之間用以阻斷或吸收光路中的激發(fā)光或某些波長較短的光線以防傷害眼睛，使熒光透過。選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長長于所需熒光的光線，并透過樣品發(fā)出的熒光。所以，阻斷濾色鏡的選用，應(yīng)視熒光染料的熒光光譜而定，以能最大限度地透過熒光和阻斷短波光。熒光顯微鏡中，除上述兩類濾色鏡外，尚有一重要的分色鏡系統(tǒng)二向色鏡，位于汞燈和激發(fā)濾色鏡構(gòu)成的平行光軸與目鏡和物鏡構(gòu)成的垂直光軸的兩軸垂直相交處，斜向安裝于光路之中。由鍍膜的光學(xué)玻璃制

17、成，其鏡面方位與上述兩光軸交角均呈45o，兼有透射長波光線和反射短波光線的功能。在熒光顯微術(shù)中承當(dāng)色光的“分流“作用。3、熒光顯微鏡的光路：熒光顯微術(shù)按激發(fā)光對樣品的激發(fā)方向或方式區(qū)分為透射式和反射（落射）式兩類。實際應(yīng)用上多用反射式。透射熒光顯微術(shù)光路：透射熒光顯微術(shù)是激發(fā)光束通過聚光器自下而上的透射樣品，誘發(fā)的熒光從物鏡前方進(jìn)入物鏡。其具體光路如下：汞燈發(fā)出的強(qiáng)光經(jīng)集光透鏡、吸熱濾色鏡、鏡臂反光鏡、激發(fā)濾色鏡、光路轉(zhuǎn)換反光鏡后光線轉(zhuǎn)射向上，進(jìn)入視場光闌，暗視場聚光器，進(jìn)入樣品，激發(fā)出的熒光射入物鏡經(jīng)阻斷濾色鏡進(jìn)入目鏡。反射熒光顯微術(shù)光路又稱落射熒光顯微術(shù)光路：因激發(fā)光由物鏡后部進(jìn)入物鏡，向

18、下落射樣品激發(fā)出熒光，熒光反射向上再進(jìn)入物鏡。其光路如圖210。4、使用方法： 經(jīng)熒光染料染色的樣品放在載物臺上，先用溴鎢燈透射照明，用低倍物鏡聚焦，待尋找到最佳影像后，熄滅溴鎢燈，改用汞燈。 點亮汞燈，觀察。5、注意事項：使用汞燈嚴(yán)禁頻繁開閉，點亮后欲暫停使用時，不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。當(dāng)汞燈熄滅后不能立刻點亮，經(jīng)5一l0min待汞燈冷卻后再通電點亮。 使用油浸物鏡時，應(yīng)用無熒光浸油。6、作業(yè)：（1）為什么暗視場照明的視場暗黑，樣品影像明亮?（2）使用暗視場照明時，為什么必領(lǐng)在聚光器與載玻片間進(jìn)行油浸?（3）相差顯微鏡有哪些特有的附件，其構(gòu)造如何？（4）相差顯微鏡鏡檢時為什么要用綠色

19、濾色鏡?（5）為什么相差顯微鏡可以直接觀察活體樣品？（6）什么是熒光?它是怎佯發(fā)生的?（7）熒光顯微術(shù)為什么要以汞燈當(dāng)光源？（8）激發(fā)濾色鏡和阻斷濾色鏡的功能及其區(qū)別?兩者有何關(guān)系?（9）二向色鏡的作用原理?如何選用?實驗二 血涂片的制作和細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞計數(shù)【實驗安排】 ( 共 3學(xué)時 ) ： 1、教師講解實習(xí)內(nèi)容，示范血涂片制作、染色 ( 約 30 分鐘 ) 。 2、同學(xué)兩人一組，相互采血，各自獨立完成血涂片制作、染色、紅細(xì)胞計數(shù) ( 約 120分鐘 ) 。 3、書寫實驗報告 【目的要求】1、掌握血涂片的制備染色方法2、認(rèn)識各種血細(xì)胞的典型形態(tài)，了解細(xì)胞形態(tài)的多樣性3、掌握細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)

20、構(gòu)和細(xì)胞計數(shù)方法一、血涂片的制備與血細(xì)胞形態(tài)觀察【實驗原理】1、血涂片的制備：涂片是一種基本的臨時制片技術(shù)。血涂片是血液學(xué)研究中最基本的技術(shù)。血涂片的制作就是將血液樣品制成單層細(xì)胞的涂片標(biāo)本的過程。經(jīng)過瑞氏染色，對各種血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。2、瑞氏染色原理：瑞氏染料是由酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料。美藍(lán)(又名亞甲藍(lán)mehylene blue)，通常為氯鹽,即氯化美藍(lán)，美藍(lán)容易氧化為天青. 伊紅(又名曙紅cosin)通常為鈉鹽即伊紅鈉。美藍(lán)和伊紅水溶液混合后產(chǎn)生一種憎液性膠體伊紅美藍(lán)中性沉淀, 即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后, 又重新解離為帶正電的美藍(lán)（藍(lán)色）和帶負(fù)電的伊紅離子（紅色）

21、。 細(xì)胞的染色即有物理的吸附作用又有化學(xué)的親和作用. 各種細(xì)胞和細(xì)胞的各種成份化學(xué)性質(zhì)不同對各種染料的親和力也不一樣. 因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各種不同的色彩嗜酸性顆粒與酸性染料伊紅結(jié)合染粉紅色;嗜堿性物質(zhì)與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合,染藍(lán)色或紫色;中性物質(zhì)成等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合,染紫紅色;M+CL + Na+E ME + NaCL 【實驗用品】1、 器材：顯微鏡、醫(yī)用采血針、酒精棉球、載玻片、血推片、染色缸2、 試劑：瑞氏染液、蒸餾水、pH6.46.8 PBS緩沖液【方法與步驟】1、 血涂片的制備與染色觀察(1)、采血：先用75%酒精棉球消毒左手無名指局部皮膚。等待干后，用

22、消毒后的刺血針刺入皮膚，深約 2 毫米。待血液從針孔流出，用干棉花擦去第一滴血。 (2)、涂片：輕輕擠壓，使血液流出形成綠豆大小的血滴。將血滴置于玻片的一端,左手持載玻片,右手以邊緣平滑的推片的一端從血滴前方后移接觸血滴，血滴即沿推片散開。然后使推片與載片夾角保持30-45度平穩(wěn)地向前移動,載片上保留下一薄層血膜。（3）、待干：血涂片制成后可手持玻片在空中揮動,使血膜迅速干燥,以免血細(xì)胞皺縮.（4）、染色：將血膜平放在染色架上. 加瑞氏染液2-3滴,使覆蓋整個血膜,固定13分鐘. 滴加等量緩沖液或新鮮蒸餾水,與染料混勻染色5-10（25）分鐘. 用清水沖去染液,待自然干燥后或用吸水紙吸干,即可

23、置血涂片于顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。（5）、觀察：分別在低倍鏡、高倍鏡、油鏡下觀察血細(xì)胞的形態(tài)。二、紅細(xì)胞計數(shù)【實驗原理】1、血細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)血細(xì)胞計數(shù)板系一長方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 計數(shù)板，在中央橫溝的兩邊各有一計數(shù)室，兩計數(shù)室結(jié)構(gòu)完全相同。計數(shù)室較兩邊的蓋玻片支柱低0.1毫米。因此，放上蓋玻片時，計數(shù)板與其間距即計數(shù)室空間的高為0.1毫米(圖8-1)。在低倍顯微鏡下可見計數(shù)室被雙線劃分成個邊長為毫米的大方格，每個大方格的容積為0.1ul。四角的大方格又各分為個中方格，這是用來計數(shù)白細(xì)胞的。中央大方格被劃分為個中方格，每一中方格又劃分成個小方格(圖82稱&

24、#215;，也有的計數(shù)板為×的，小方格面積一致)。中央大方格的四角及中心個中方格(×者則為四角上的中方格)為紅細(xì)胞或血小板計數(shù)范圍。2、血細(xì)胞計數(shù)：用相應(yīng)的稀釋液將血液稀釋若干倍，置于計數(shù)室中，在顯微鏡下計數(shù)一定容積內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)。 稀釋血液有血細(xì)胞吸管法和試管法，本實驗采用后者。 計算公式：5個中方格內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)×5×10×106×200（稀釋倍數(shù)）= 紅細(xì)胞數(shù)/L血液【實驗用品】1、 器材：顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板、移液管2、 試劑：生理鹽水、抗凝全血【方法與步驟】1、 血液稀釋：用移液管量取0.1ml抗凝全血，加入19.9ml生理鹽水中

25、稀釋，混勻。2、 充液：取干潔的計數(shù)板，置于水平的桌面上，蓋上蓋玻片，使兩側(cè)各空出少許。搖勻血細(xì)胞懸液，用滴管吸取，將滴管尖輕輕置于蓋玻片邊緣外，讓滴出的血細(xì)胞懸液憑毛細(xì)管作用吸入計數(shù)室內(nèi)，剛好充滿計數(shù)室為宜。靜置min后計數(shù)，先用低倍鏡觀察，不均勻則拋棄，再重新充液。3、 計數(shù)：找到計數(shù)室位置。采用“由上至下，由左至右，順序如弓”的順序，對壓邊線細(xì)胞采取“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則(圖84)。依次計數(shù)并記錄個中方格中分別有多少個紅細(xì)胞。4、 計算：按計數(shù)室構(gòu)造及血液稀釋倍數(shù),將紅細(xì)胞計數(shù)結(jié)果換算成每升血液中紅細(xì)胞的個數(shù)。【實驗注意事項】1、 使用玻片時只能手持玻片邊緣,切勿觸及玻片表面;

26、,以保持玻片清潔,干燥,中性、無油膩。2、 細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感,配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇,沖洗用水應(yīng)近中性, 否則各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常,致使細(xì)胞的識別困難,甚至造成錯誤。3、 推片時用力要均勻，否則容易形成波浪狀，厚薄不勻。4、 一張良好的血片,要求厚薄適宜,頭體尾分明,分布均勻,邊緣整齊, 兩側(cè)留有空隙。5、 血膜未干透,細(xì)胞尚未牢固附在玻片上,在染色過程中容易脫落, 因此血膜必需充分干燥. 血片制好后最好立即固定染色,以免細(xì)胞溶解和發(fā)生退行性變。6、 染色時間與染液濃度,室溫高低,細(xì)胞多少有關(guān).染液越淡,室溫越低, 細(xì)胞越多,所需染色時間越長，或應(yīng)適當(dāng)增加染液量,因此染色時間應(yīng)

27、視具體情況而定.7、 染液不可過少,以防蒸發(fā)干燥染料沉著于血片上難沖洗干凈.8、 沖洗時應(yīng)用流水將染液沖去.不能先倒掉染液,以免染料沉著于血片上.9、 充液前應(yīng)充分混勻血細(xì)胞懸液，充液要連續(xù)、適量，充液后應(yīng)待血細(xì)胞下沉后再計數(shù)。10、計數(shù)板、蓋玻片、吸血管、血片等用過后必須立即按要求洗滌干凈。染色結(jié)果在正常情況下血膜外觀為粉紅色,在顯微鏡下紅細(xì)胞呈肉紅色；白細(xì)胞胞漿能顯示各種細(xì)胞的特有色彩,細(xì)胞核染紫紅色,染色質(zhì)清楚, 粗細(xì)松緊可辨。染色結(jié)果偏酸,則紅細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞顆粒偏紅,白細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或不著色；染色結(jié)果偏堿,則所有細(xì)胞染成灰藍(lán)色,顆粒深暗，嗜酸性顆?？扇境砂岛稚?甚至紫黑色或藍(lán)色。嗜

28、中性顆粒偏粗,偏堿(紫黑色).血片原處呈綠色.【實驗報告】1、 記錄血涂片中各種類型細(xì)胞形態(tài)及染色結(jié)果2、 計算每升血液中紅細(xì)胞的數(shù)量實驗三 葉綠體的分離與觀察【實驗安排】 ( 共 3學(xué)時 ) ： 1、教師講解( 約 30 分鐘 ) 2、同學(xué)六人一組，分離葉綠體 3、書寫實驗報告 【目的要求】1. 通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。2. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光并熟悉熒光顯微鏡的使用方法【實驗原理】將植物組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀、稠密度，也與離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一

29、給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L 氯化鈉或0.4mol/L 蔗糖溶液)中進(jìn)行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。將勻漿液在1000 r/min 的條件下離心2min，以去除其中的組織殘渣和一些末被破碎的完整細(xì)胞。然后在3000 r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。分離過程最好在04的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察?！緦嶒炗闷贰?一) 材料 新鮮菠菜

30、（二）器材 普通離心機(jī)、研缽、天平、光學(xué)顯微鏡、250m1 燒杯2 個、250m1 量筒1 個、滴管10 支、10m1離心管10 支、紗布若干、載玻片和蓋片等。（三）試劑 0.35mol/L NaCl 溶液，0.01%丫啶橙【方法與步驟】1. 游離葉綠體的制備與觀察（1） 選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱30g 于150ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。（2）利用組織搗碎機(jī)低速(5000 r/min)勻漿35min。（3）將勻漿液用6 層紗布過濾，收集于500m1 燒杯中。（4）取濾液4m1 在1000 r/min 下離心2min。棄去沉淀。（5）將上

31、清液在3000 r/min 下離心5min。棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。（6）將沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液懸浮。（7）取葉綠體懸液1 滴滴于載片上，加蓋片后即可在普通光鏡下觀察。（8）取葉綠體懸液1 滴滴于無熒光載片上，加蓋片后在熒光顯微鏡下觀察自發(fā)熒光。（9）取葉綠體懸液1 滴加0.01%丫啶橙1滴混合后，滴于無熒光載片上，加蓋片后在熒光顯微鏡下觀察次生熒光。2、菠菜葉手切片觀察用剃須刀將新鮮的嫩菠菜葉切削一斜面置于載片上，滴加1滴0.35mol/L的NaCL,加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察。（1）在普通光鏡下觀察。（2）在熒光顯微鏡下觀察。（3）用同樣方法制片

32、，但滴加l一2滴0.01丫啶橙染液染色染色1min，洗去余液，熒光顯微鏡下觀察。3. 組織中葉綠體的觀察取新鮮植物嫩葉適量，放入研缽中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上層浸出液，鏡下觀察葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的葉綠體和保衛(wèi)細(xì)胞等形態(tài)。【實驗結(jié)果】一、葉綠體的分離與觀察1. 在普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。2. 在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色自發(fā)熒光；3. 加入丫啶橙染色后，葉綠體發(fā)出桔紅色次生熒光而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。二、菠菜葉手切片觀察1、在普通光鏡下可以看到3種細(xì)胞(1)表皮細(xì)胞：為邊緣呈鋸齒

33、形的鱗片狀細(xì)胞。(2)保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細(xì)胞。(3)葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長形和橢圓形細(xì)胞。葉綠體呈綠色檄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。2在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強(qiáng)度要比游離葉綠體弱，氣孔發(fā)綠色熒光。兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。3用丫啶橙染色后葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)出綠色熒光、氣孔仍為綠色，三、組織中葉綠體的觀察1. 表皮細(xì)胞呈鱗片狀或不規(guī)則形，常與氣孔連在一起，呈無色。2. 葉肉細(xì)胞呈長方形或類方形，內(nèi)含有大量帶有綠色的葉綠體顆粒細(xì)胞，后者有時呈單一或多個排列。另外，視野下還可

34、見到大量散在的點狀或類圓狀葉綠體顆粒。3. 葉脈導(dǎo)管呈螺紋狀。4. 保衛(wèi)細(xì)胞呈腎狀，兩個組成一個氣孔。5. 氣孔有時呈紡錘形、圓形（開放時），有時呈條形（閉合時）?！緦嶒瀳蟾婕白鳂I(yè)】1. 畫出分離后的細(xì)胞組分（注明形態(tài)的放大倍數(shù)）。2. 分離細(xì)胞組分時，為什么要加入0.35mol/L 氯化鈉？實驗四 細(xì)胞膜的通透性實驗五 植物凝集素對RBC的凝集作用【實驗安排】1、實驗原理講解；（30分鐘）2、細(xì)胞凝集反應(yīng)；（40分鐘）3、細(xì)胞膜的滲透性。（50分鐘）4、實驗小結(jié) ：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。 （

35、15分鐘）【實驗?zāi)康摹?、 了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。2、 掌握細(xì)胞凝聚的原理；3、 熟悉凝集素；4、 了解凝集素對細(xì)胞凝集的特異性。【實驗原理】1、細(xì)胞膜的滲透性滲透：在半透膜隔開的兩種不同濃度的溶液之間，水分子通過半透膜由低濃度一側(cè)流向高濃度一側(cè)的現(xiàn)象。擴(kuò)散：在半透膜隔開的兩種不同濃度的溶液之間，溶質(zhì)分子通過半透膜從高濃度一側(cè)向低濃度一側(cè)移動的現(xiàn)象。等滲溶液：滲透壓相等的溶液。滲透壓：在滲透作用進(jìn)行時，溶液中溶質(zhì)所具有的吸引和保留水分子的力量稱為滲透壓。當(dāng)紅細(xì)胞置于不同種等滲溶液中時，由于對各種溶質(zhì)的通透性不同，有的溶質(zhì)可透入，有的不能滲入。滲入紅細(xì)胞的溶質(zhì)就可提高紅細(xì)胞

36、的滲透壓，使細(xì)胞外水分進(jìn)入紅細(xì)胞，引起細(xì)胞膨脹破裂，導(dǎo)致溶血。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時間也不同。2、細(xì)胞凝集反應(yīng)： 細(xì)胞外被：細(xì)胞膜外表面的一層粘多糖物質(zhì)。參與細(xì)胞粘著、細(xì)胞識別、細(xì)胞生長分化、免疫反應(yīng)等；凝集素：一類含糖的，并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，具有凝集細(xì)胞，刺激細(xì)胞分裂的作用。凝集素的特點：一種凝集素具有只對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力；另一方面，凝集素具有多價結(jié)合能力。凝集原理：與細(xì)胞表面的糖分子連接，在細(xì)胞間形成 “橋”的結(jié)果。加入與凝集素互補的糖分子可以抑制細(xì)胞間的凝集反應(yīng)。凝集素是一類從各種植物種子和動物組織中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。因其能凝集紅細(xì)胞，故名凝集素，亦

37、稱外源凝集素。除紅細(xì)胞外，還能凝集淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞、精子等。常用的為植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如刀豆素A（ConA）、麥胚凝集素(WGA)、植物血激素(PHA)、花生凝集素(PNA)等，凝集素(Ietin)是其總稱。日前已純化并鑒定的植物凝集素有近100種。凝集素最大的特點是能識別糖蛋白和糖脂中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基。一種凝集素具有只對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力如刀豆素A與吡喃糖基甘露糖結(jié)合，麥芽素與N乙酰糖胺（Nacetyl glucosamine）結(jié)合；菜豆凝集素與N乙酰乳糖胺結(jié)合。因此，凝集素可以作為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的探針。另一方面，凝集

38、素具有多價結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合、而不影響其生物活性，從而在光鏡與/或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。在探索細(xì)胞分化、增生和惡變的生物學(xué)演變過程，顯示腫瘤相關(guān)抗原物質(zhì)，以及對腫瘤的診斷評價等方面均有一定的價值?！緦嶒炗闷贰浚ㄒ唬⒉牧希喝搜?xì)胞、土豆。（二）、器材： 離心機(jī)、載玻片、天平、滴管、刀片、小燒杯，試管、試管架，移液管、吸耳球、秒表。（三）、試劑： 1. 蒸餾水。2. 0.17mol/L NaCl 溶液。3 0.17 mol/L NH4Cl4 0.17 mol/L NaNO3溶液。5. 0.12 mol/L Na2SO4 溶液。6. 0.32 mol/L 葡萄

39、糖。7. 0.32 mol/L 甘油。8. 0.32 mol/L 乙醇。9. 0.32 mol/L 丙酮。10. 生理鹽水11. PBS緩沖液【實驗步驟】一、細(xì)胞膜的通透性1、血細(xì)胞懸液的制備： 血液：生理鹽水 = 1：102、低滲溶血觀察： 3ml蒸餾水+ 0.3ml RBC懸液，混勻。 溶血現(xiàn)象的觀察：透明度、離心3、RBC對物質(zhì)的滲透性觀察： 3ml溶液+ 0.3ml RBC懸液試管編號是否溶血溶血時間結(jié)果分析1、0.17mol/LNaCI+RBC2、0.17 mol/L NH4Cl+RBC3、0.17 mol/L NaNO3+RBC4、0.12 mol/L Na2SO4 +RBC5、0

40、.32 mol/L 葡萄糖+RBC6、0.32 mol/L 甘油+RBC7、0.32 mol/L乙醇+RBC二、細(xì)胞凝集反應(yīng)1、提取植物凝集素：土豆去皮，稱取20g ，切成薄片，加入100mlPBS緩沖液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素）2、制備2%的RBC懸液：（1）、洗滌血細(xì)胞：2ml抗凝全血中加入8ml NS，2000r/min離心5min,棄去上清，再加入生理鹽水，反復(fù)洗滌5次；（2）、制備2%的血細(xì)胞懸液：經(jīng)過洗滌的RBC，按壓積用生理鹽水配成2%的RBC懸液。（3）、細(xì)胞凝集觀察：載玻片上滴一滴土豆凝集素 ，再滴一滴2紅細(xì)胞懸液 ，充分混勻，靜置20 min，觀察血球

41、凝集現(xiàn)象。PBS緩沖液加2血細(xì)胞懸液作為對照實驗 【作業(yè)】1、 分析比較細(xì)胞膜通透性實驗中所觀察到的結(jié)果2、 推斷下列溶液的溶血反應(yīng)：0.17mol/L KCI 、0.17mol/L KNO3、0.12mol/L MgCI2、0.12mol/L(NH4)2SO4、0.32mol/L甘露醇、0.32mol/L蔗糖3、繪圖表示血細(xì)胞凝集現(xiàn)象，并說明原因。表61 常見的凝集素一覽表凝 集 素縮 定特異性結(jié)合花生（ Peanut agglutinin）PNAD半乳糖、Gal(13)GalNAC刀豆（Concanavalin ensifomis agglutinin）ConAD-葡萄糖、D-甘露糖蓖麻（

42、Ricinus communis agglutinin）RCAD半乳糖、D-GalNAC>半乳糖扁豆（Lens cuinaris agglutinin0LCAD-甘露糖、D葡萄糖豌豆（Pisum satiwum agglutinin）PSAD-甘露糖菜豆（Phaseolus vulgaris agglutinin）PHAD-GalNAC大豆（soybean agglutinin）SBAD-GalNAC>>D-半乳糖荊豆（Ulex europeaus agglutinin）UEAL-巖藻糖麥胚(Wheat germ agglutinin)WGAD-GalNAC、NANA(Ban

43、deiraea simplicifolia agglutinin)BSAD-半乳糖雙花扁豆（Dolichos bifows agglutinin）DBAD-GalNAC槐（Sophora japonica agglutinin）SJAD-半乳糖、D-GalNAC實驗六 DNA的Feulgen染色【實驗安排】1、講解實驗原理、操作過程、注意事項。2、分組實驗：6人一組【實驗?zāi)康摹?、 掌握Feulgen反應(yīng)顯示DNA的組織化學(xué)過程 2、 掌握Feulgen方法的基本原理 3、 了解DNA的分布部位 【實驗原理】利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯 色劑在細(xì)胞中的定位及

44、顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。 標(biāo)本經(jīng)1N HCl 、60水解，可將DNA分子中嘌呤堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵打斷，使嘌呤脫下，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團(tuán)，故可呈現(xiàn)出紫紅色，從而顯示出DNA的分布。細(xì)胞中只有DNA才具有這種專一的孚爾根反應(yīng)。 2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3Schiff試劑的基本成分是堿性品紅，偏亞硫酸氫鈉(NaHSO3)和鹽酸。堿性品紅的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。堿性品紅原為桃紅色，當(dāng)與亞硫酸作用時還原，使醌型變?yōu)楸叫?，由桃紅色變?yōu)闊o色透明的N-

45、亞磺酸亞硫酸副品紅堿，當(dāng)它與醛基作用時，其分子式又恢復(fù)為醌型結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)紫紅色?！緦嶒炗闷贰?、 器材 顯微鏡、立式染色缸、水浴鍋、鑷子，蓋玻片 2、 材料 用carnoys固定液固定的洋蔥根尖。 3、 試劑 1mol/L HCl、Schiff氏試劑、carnoys固定液、漂洗液、0.5%亮綠水 溶液【實驗步驟】（一）、實驗組1、 carnoys固定液固定的洋蔥根尖放入蒸餾水中漂洗2、 移入1 mol/L HCl的染色缸內(nèi)清洗1min3、 60的1 mol/L HCl溶液中水解8 min 4、 取出標(biāo)本，放入室溫1 mol/L HCl溶液5、 蒸餾水沖洗3次（使水解停止）6、 Schiff試劑中

46、染色40min 7、 用亞硫酸水洗35次(以洗去多余的非特異性色素及擴(kuò)散的染料)8、 流水沖洗5 min 9、 蒸餾水洗片刻 10、 1%亮綠復(fù)染數(shù)秒鐘（注意: 復(fù)染時間切忌過長，以免染色過深，影響對DNA的觀察）（二）對照省略步驟3、4，其余同實驗組【實驗結(jié)果】    細(xì)胞核中的DNA呈紫紅色反應(yīng)，它不但反應(yīng)出DNA存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應(yīng)的深淺，來判斷DNA的相對含量。細(xì)胞質(zhì)被亮綠復(fù)染成綠色，核仁通常為綠色?！咀⒁馐马棥?. 對照的制做 進(jìn)行Feulgen反應(yīng)時, 一般要做一對照切片以便驗證反應(yīng)結(jié)果。對照切片應(yīng)不經(jīng)水解直接放在schiff劑內(nèi)

47、。但需要注意的是，對照切片在schiff試劑中最多不要超過1 h (0.5 h即可)，時間過長，試劑本身的酸性也會使DNA水解，從而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 2. 水解時間 Feulgen反應(yīng)通常用稀酸進(jìn)行水解，但水解的時間一定要適當(dāng)。如水解時間不夠, 反應(yīng)就會變?nèi)酰蝗缢鈺r間過長?；蛩獾剡^于劇烈，則脫氧核糖也易掉下來，反應(yīng)也會減弱。適當(dāng)?shù)乃鈺r間一般為812min。但是水解時間長短也要視標(biāo)本的類型(如厚薄等)、固定劑的性質(zhì)以及酸的濃度而定。 3、Schiff試劑的作用     Feulgen反應(yīng)成功與否的一個非常關(guān)鍵的因素，就是schiff試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱

48、為堿性品紅，它們實際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應(yīng)用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)?！緦嶒瀳蟾妗?、繪圖表示Feulgen反應(yīng)的染色結(jié)果2、總結(jié)Feulgen反應(yīng)染色結(jié)果的影響因素。Feulgen方法應(yīng)注意的幾個問題： 1. 對照切片的制做 實驗七 細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察【實驗?zāi)康摹空莆罩参锛?xì)胞骨架的光鏡標(biāo)本制作方法。【實驗原理】細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞的生長、運動、分裂、分化和物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔?。本實驗用普通光鏡觀察到

49、細(xì)胞骨架，是因為骨架纖維成束分布、結(jié)構(gòu)經(jīng)染色后，有夸大作用。由于細(xì)胞經(jīng)TritonX-100抽提后剩下的主要是細(xì)胞骨架成分，使得顯現(xiàn)更清晰。光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)觀察多用1% Triton X-100處理細(xì)胞，能溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻不被破壞顯得更清晰，M-緩沖液洗滌細(xì)胞，可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，戊二醛固定能較好地保存細(xì)胞骨架成分，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可使細(xì)胞骨架蛋白著色，而胞質(zhì)背景著色弱，有利細(xì)胞骨架纖維顯示。由于有些細(xì)胞骨架纖維在該實驗條件下不夠穩(wěn)定，例如微管；還有些類型的纖維太細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的張

50、力纖維，直徑約40nm左右。張力纖維形態(tài)長而直，常常與細(xì)胞的長軸平行并貫穿細(xì)胞全長?？捡R斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，它可以使各種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)著色，并非特異地顯示微絲。 染色時用的M-緩沖液，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合Ca2+離子，溶液中并提供Mg2+離子，在此低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張?！緦嶒炗闷贰?、 實驗材料：新鮮洋蔥鱗莖2、 實驗器材：普通光學(xué)顯微鏡，小燒杯，滴管，試劑瓶載玻片，蓋玻片，鑷子、吸水紙，擦鏡紙3、 試劑1） M緩沖液（pH 7.2）各成分終濃度為：50mmol/L咪唑(MW:68.08), 50mmol/L KCl(MW:74.5

51、5), 0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30), 1mmol/L EGTA(MW:380.36), 0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24),1mmol/L DTT(MW:154.3)2） 6mmol/L PBS磷酸緩沖液 （pH 6.5）: KH2PO4 : Na2HPO4·2H2O = 7:3 (見附錄3 查磷酸緩沖液的配置)3） 0.9% 生理鹽水4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-緩沖液5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL 6） 0.2% 考馬斯亮藍(lán)R

52、250染液 200mL: 考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g, 甲醇 46.5mL, 冰乙酸 7mL, 蒸餾水46.5 mL各種試劑成分的作用：1、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非離子去垢劑，適當(dāng)濃度的Triton X-100，可使細(xì)胞膜溶解，而細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架系統(tǒng)可被保存。2、M緩沖液 和磷酸緩沖液作用：維持細(xì)胞的滲透壓3、EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金屬離子；后者專一性螯合Ca2，主要是高濃度的Ca2可使微管解聚，因此加入EGTA來降低Ca2的濃度 。4、戊二醛作用：良好的固定劑，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持它原有狀態(tài)5、考馬斯亮蘭作用

53、：非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白著色（藍(lán)色）【實驗步驟】1、撕取洋蔥鱗莖近中軸內(nèi)表皮約l cm2大小和靠近外層鱗片內(nèi)表皮約l cm2大小做對照，置于裝有pH6.8磷酸鹽緩沖液的燒杯中，用鑷子輕按入使其浸沒5min。 2吸去磷酸鹽緩沖液用1Triton X100處理60min。3吸去Triton X100液，用M緩沖液洗3次，每次5min左右。4用3戊二醛固定30min。5再用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5min。60.2考馬斯亮藍(lán)R250染色15min(在載玻片上)。7用蒸餾水洗12次，將樣品置于載玻片上，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，先低倍，再高倍，最后用油鏡?！緦嶒灲Y(jié)果】洋蔥不同鱗莖部位光鏡觀察結(jié)果1

54、、取材2、光鏡觀察結(jié)果【結(jié)果分析】1、洋蔥不同鱗莖部位光鏡觀察結(jié)果2、人口腔上皮細(xì)胞骨架觀察結(jié)果【注意事項】1、取洋蔥近中軸內(nèi)層中下部的內(nèi)表皮細(xì)胞 2、用滴管吸取緩沖液漂洗時不要洗掉樣品 3、染色、水洗均在表面皿上操作4、顯微鏡觀察時先用低倍鏡找，找到后轉(zhuǎn)高倍鏡觀察人口腔上皮細(xì)胞的光鏡觀察 1、涂片：用干凈牙簽刮取人口腔上皮細(xì)胞，置于1.5ml離心管中，加1ml生理鹽水，混勻后3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，剩0.5ml上清液，吹管吹打均勻、涂片、晾干。2、漂洗：M緩沖液洗3次。3、處理：1Triton X100 37處理30分鐘，M緩沖液洗3次。4、固定：3戊二醛固定15分鐘，磷酸緩沖液洗3次，濾紙

55、吸干。5、染色：0.2考馬斯亮藍(lán)R250染色5分鐘6、封片：水洗制成臨時片，鏡檢。 人口腔上皮細(xì)胞骨架觀察結(jié)果實驗八 線粒體的超活染色與觀察【實驗?zāi)康摹?. 觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。2. 學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)?！緦嶒炘怼炕铙w染色是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織某些結(jié)構(gòu)能著色但又不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡的一種染色方法。因此活染技術(shù)通常可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分主要是染料的“電比學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離