車前草提取黃酮物降低急性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平

1、車前草提取物黃酮降低急性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平1.目的：探討車前草提取物黃酮對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響2.國內(nèi)外前景：痛風(fēng)( gout) 是由于嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂，產(chǎn)生尿酸過多和( 或) 尿酸排泄減少，血尿酸濃度持續(xù)增高導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶沉積軟組織所致的一組代謝性疾病，高尿酸血癥是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)。隨著人們生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)和高尿酸血癥的患病率在全球范圍呈逐年上升的趨勢(shì)。現(xiàn)有的用于治療痛風(fēng)的藥物副作用比較多。相對(duì)于秋水仙堿、苯溴馬隆等藥物，臨床使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇相對(duì)安全，但仍有約2%的病人治療3 周后可見皮疹及皮膚瘙癢，繼續(xù)用藥會(huì)造成過敏綜合癥1，

2、需要終止治療。最新在美國批準(zhǔn)上市的另一種黃嘌呤氧化酶抑制劑抗痛風(fēng)藥物非布索坦其安全性并沒有高于別嘌呤醇2。因此從天然草藥中尋找更為安全的抗痛風(fēng)替代藥物仍是藥學(xué)研究的熱點(diǎn)。3.發(fā)展趨勢(shì)：車前草具有一定的抗痛風(fēng)效果，在體外對(duì)黃嘌呤氧化酶具有抑制作用3，但其抗高尿酸血癥及機(jī)理研究報(bào)道較少。另外，中草藥抗痛風(fēng)藥物研究其機(jī)理仍主要集中在黃嘌呤氧化酶及腎尿酸轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白作用靶點(diǎn)，而對(duì)其它作用靶點(diǎn)研究較少。本研究在建立氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)的小鼠急性高尿酸血癥模型的基礎(chǔ)上，深入探討車前草對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響及其作用機(jī)理，以期為其抗痛風(fēng)藥用開發(fā)提供參考。4. 實(shí)驗(yàn)原理：車前草提取物黃酮能夠降低高尿酸血癥模型

3、小鼠的血尿酸，改善高尿酸血癥小鼠腎臟功能。黃嘌呤氧化酶是調(diào)控尿酸生成的最終環(huán)節(jié)，在高尿酸血癥的發(fā)病中占有重要的地位。同時(shí)，腺苷脫氨酶ADA 是腺苷酸分解代謝的重要酶之一，在嘌呤分解代謝中具有重要作用。最新研究表明，ADA 活性的增加會(huì)升高機(jī)體體內(nèi)黃嘌呤與次黃嘌呤的濃度6，7，進(jìn)而影響尿酸的代謝。車前草提取物黃酮抑制XOD 與ADA 活性并下調(diào)腎臟mUAT1mNA 的表達(dá)是其降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的作用機(jī)制。5.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：車前草采自江西九江，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室張壽文教授鑒定為車前科植物車前草Plantago asiatica L的干燥全草。6.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60 只成年雄性小鼠。7

4、.實(shí)驗(yàn)器械及藥物 7.1實(shí)驗(yàn)器械：高速冷凍離心機(jī)，超低溫冰箱，電熱恒溫水溫箱，電子分析天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，UV2100紫外可見分光光度儀，PC 擴(kuò)增儀，XOD 測(cè)定試劑盒，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)試盒，ADA 測(cè)定試劑盒，尿酸測(cè)定試劑盒，動(dòng)物NAprep Pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒。7.2實(shí)驗(yàn)藥物：氧嗪酸鉀鹽，別嘌呤醇片，雙蒸水M MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，車前草提取物黃酮，生理鹽水。8.實(shí)驗(yàn)方法：1 車前草總黃酮提取：國內(nèi)外研究車前草總黃酮提取工藝已較多,本課題選用了文獻(xiàn)報(bào)道中的最優(yōu)提取方案7, 8 ,能最大限度地提取到黃酮類成分,也為車前草黃酮提取物及其飲片中黃酮類成分的檢測(cè)提供了方法。2 樣品對(duì)高

5、尿酸血癥小鼠的影響2 1小鼠分組及給藥將60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、高尿酸血癥組( 模型組) 、別嘌呤醇組( 陽性藥組) 、車前草低劑量組、車前草中劑量組和車前草高劑量組。其中車前草低、中、高劑量組給藥劑量分別為117，234，468 g /kg，別嘌呤醇混懸于08% CMCNa中，其劑量為10 mg /kg。空白對(duì)照和模型對(duì)照組，灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水。按0 15ml /10g 灌胃給藥。連續(xù)給藥7 d，每天一次，最后一次于造模1h后給藥。2 2 高尿酸血癥小鼠模型的建立采用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀鹽為化學(xué)誘導(dǎo)劑，抑制小鼠體內(nèi)尿酸分解，造成小鼠高尿酸血癥模型。于

6、給藥前1 h，按照400 mg /kg 劑量，對(duì)小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀鹽( 混懸于08% CMCNa 溶液) ?？瞻讓?duì)照組腹腔注射相應(yīng)體積08% CMCNa 溶液。給藥1 h 后，小鼠眼眶后靜脈叢采血，全血10000 r /min 離心10 min，離心后上層血清置于4冰箱中備用。并于冰臺(tái)快速分取肝臟組織塊與腎臟，立即投入液氮中冷凍，取出后置于70冰箱中保存。2 3 血清尿酸與肌酐水平檢測(cè)采用尿酸測(cè)定試劑盒與肌酐測(cè)定試劑盒。2 4 肝臟黃嘌呤氧化酶( xanthine oxidase，XOD) 及腺苷脫氨酶( Adenosine deaminase，ADA) 活性測(cè)定肝臟組織塊稱重后按體積比加9

7、 倍預(yù)冷的生理鹽水制成10%勻漿，2500r /min 離心10 min，取上清按照試劑盒規(guī)定方法測(cè)定蛋白含量和XOD 及ADA活性。2 5 TPC 法測(cè)定腎臟尿酸轉(zhuǎn)體mUAT1 mNA 表達(dá)每組取10個(gè)腎臟樣品，每個(gè)樣品0 02 g，加入300 l 裂解液，按照試劑盒說明書提取總NA。取總NA 1l，加DEPC 水稀釋后，在260、280 nm下測(cè)定吸光度( A)值，以A260 /A280值確定其純度。利用12% 瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定，在紫外燈下觀察總NA完整性。取8l 總NA，按照Promaga 反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書上操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。引物序列和PC 擴(kuò)增反應(yīng)按照文獻(xiàn)4中所

8、述進(jìn)行。簡言之，引物序列分別為mUAT1 ( 5'GCTACCAGAATCGGCACGCT 3'5' CACCGGGAAGTCCACAATCC 3') ，GAPDH ( 5'GAGAAGATTTGGCACCACAC 3'5'CATCACAATGCCAGTGGTAC3') 。PC反應(yīng)體系總體積25l。mUAT1 基因和GAPDH 基因擴(kuò)增條件為95 預(yù)變性2 min;94變性30 s，58退火35 s，72延伸45 s，共35個(gè)循環(huán); 72延伸10 min。PC擴(kuò)增產(chǎn)物20保存。PC 產(chǎn)物經(jīng)12% 瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色后，在

9、凝膠影像分析儀上進(jìn)行成像，并對(duì)條帶進(jìn)行吸光度分析。計(jì)算待測(cè)基因與GAPDH 的比值，從而得到待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)值。2 3 數(shù)據(jù)處理采用Studentst檢驗(yàn)雙尾分析，結(jié)果以珋x ± s 表示。9.觀測(cè)指標(biāo)： 血清尿酸與肌酐水平檢測(cè) 采用尿酸測(cè)定試劑盒與肌酐測(cè)定試劑盒。 肝臟黃嘌呤氧化酶( xanthine oxidase，XOD) 及腺苷脫氨酶( Adenosine deaminase，ADA) 活性測(cè)定 RT-PCR 法測(cè)定腎臟尿酸轉(zhuǎn)體 mUAT1 mNA 表達(dá) 10.預(yù)期結(jié)果：樣品對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸及肌酐水平的影響 高尿酸血癥模型組小鼠血清尿酸水平顯著地高于正常 。陽性對(duì)照

10、藥別嘌呤醇在給藥劑量為nmg/kg 時(shí)能顯著地降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，與模型組小鼠血清尿酸水平有極顯著性差異，并且將小鼠血清尿酸水平降低到正常小鼠以下，與正常小鼠血清尿酸水平也有較顯著差異。車前草低、中、高劑量組均可顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平。高尿酸血癥模型組小鼠血清肌酐水平顯著地高于正常小鼠血清尿酸水平。陽性對(duì)照藥別嘌呤醇能顯著地降低高尿酸血癥小鼠血清肌酐水平，與模型組小鼠血清肌酐水平有極顯著性差異，并且將小鼠血清肌酐水平降低到正常小鼠水平以下。車前草低、中、高劑量組均可降低高尿酸血癥小鼠血清肌酐水平。 表1 車前草和別嘌呤醇對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸與肌酐水平的影響( x &

11、#177; s)組別 給藥劑量/g·kg 1 血清尿酸/mol·L 1 血清肌酐/mol·L 1空白對(duì)照組高尿酸血癥組別嘌呤醇組車前草低劑量組車前草中劑量組車前草高劑量組樣品對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟 XOD 及 ADA 活性的影響 車前草低劑量組對(duì)肝臟黃嘌呤氧化酶抑制作用不明顯，而別嘌呤醇組和車前草中、高劑量組對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟 XOD 活性均有一定抑制作用。高尿酸血癥能顯著提高肝臟 ADA 的活性，別嘌呤醇組對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟 ADA 的活性幾乎沒有抑制作用，但車前草低、中、高劑量組對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟 ADA 活性均有較強(qiáng)抑制作用。 表2 車前草和別嘌呤醇對(duì)高

12、尿酸血癥小鼠肝臟XOD 及ADA 活性的影響( x ± s)組別 給藥劑量/g·kg 1 XOD 活性/U·g 1 ADA 活性/U·mg 1空白對(duì)照組高尿酸血癥組別嘌呤醇組車前草低劑量組車前草中劑量組車前草高劑量組 樣品對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 mUAT mNA 的表達(dá)影響。與空白對(duì)照組比較，模型組腎臟 mU AT1 mNA 提高。與模型組比較，不同劑量車前草給藥組、別嘌呤醇組均顯著抑制 mUAT1 mNA 的表達(dá)11.創(chuàng)新之處：黃酮類化合物具有廣泛的藥理作用。植物中提取的一些黃酮類，如蘆丁、槲皮素有降尿酸效果，表現(xiàn)出一定的抗痛風(fēng)作用8。車前草中

13、含有大量的黃酮類化合物，可能為其抗痛風(fēng)作用的有效成分，這有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1 Okamoto KInhibitors of xanthine oxidoreductaseJ Nihon Rinsho，2008， 66( 4) : 7482 Smith HS，Bracken D，Smith JM Gout: current insights and future perspectivesJ J Pain，2011， 12( 11) : 11133 Kong LD，Cai Y，Huang WW，et al Inhibition of xanthine oxidase by some Chin

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