藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)

1、藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) 肝纖維化南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 鄭仕中鄭仕中 教授、博導(dǎo)教授、博導(dǎo) 2009年AASLD (American association for the study of liver diseases)主席、美國(guó)西奈山醫(yī)學(xué)院肝病研究中心主任弗里德曼（Friedman）教授在專(zhuān)題會(huì)上介紹了肝纖維化模型的研究歷史和進(jìn)展。肝纖維化主要的模型包括動(dòng)物模型和體外模型。 目前的肝纖維化動(dòng)物模型可模仿人肝硬化發(fā)生過(guò)程，是研究肝硬化發(fā)病機(jī)制和藥物療效的重要方法。 肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與沉積，是慢性肝病重要的病理特征，也是進(jìn)一步向

2、肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。 在體外模型上，肝星狀細(xì)胞（HSC）在肝纖維化發(fā)病中的作用得到深入探討。HSC梯度離心分離和體外培養(yǎng)研究的建立與推廣應(yīng)用始于上世紀(jì)八十年代，為研究肝臟基質(zhì)的產(chǎn)生和作用（如硬度、收縮性、組成、比較生物學(xué)等）提供了有力工具，并證實(shí)HSC具有產(chǎn)生膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的能力，在肝損傷和纖維化發(fā)病中起重要作用。 研究證實(shí)，HSC體外激活模型可復(fù)制許多但不是全部的體內(nèi)激活特征。因此分離和培養(yǎng)肝臟內(nèi)其他細(xì)胞也極為重要。動(dòng)物模型 臨床上肝纖維化的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到病毒復(fù)制、炎癥介質(zhì)釋放、免疫功能紊亂、自由基損傷等多個(gè)環(huán)節(jié)。因此，在抗肝纖維化藥物研究中可采取在損傷機(jī)制不同的多個(gè)模型上觀察

3、藥物的保肝作用，綜合判斷藥效和作用機(jī)制。以下介紹幾種目前國(guó)際上常用的肝纖維化模型，中毒機(jī)制的研究也較為深入。肝纖維化造模 肝纖維化動(dòng)物模型的建立方法主要包括：化學(xué)藥物或毒物所致肝纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，如:四氯化碳；膽管阻塞 (BCM)、慢性酒精中毒性、實(shí)驗(yàn)性免疫法、致癌物致肝纖維化動(dòng)物模型等。 動(dòng)物的選擇:主要有小鼠、大鼠、鴨、家兔、家犬、獼猴等,但從造模的成功性、簡(jiǎn)便性、穩(wěn)定性及經(jīng)濟(jì)性等方面考慮,目前大多選擇大鼠制備模型。HF造模： CCl4 法制備HF動(dòng)物模型 致癌物及毒物（化學(xué)性）HF動(dòng)物模型 膽管阻塞法誘導(dǎo)HF模型 免疫性HF動(dòng)物模型 高脂造HF模型 血吸蟲(chóng)性HF動(dòng)物模型的制備 金屬離子

4、攝入建立HF模型 復(fù)合因素致肝纖維化模型 四氯化碳(CCI4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型： 四氯化碳又稱(chēng)四氯甲烷,主要用于制造二氯二氟甲烷和三氯氟甲烷,還可用于制造氯仿和其它藥物,也可用作溶等。 CCl4法造模的途徑有口服、腹腔注射及皮下注射,依據(jù)藥途徑和劑量的不同,所需時(shí)間8周至4個(gè)月不等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明,四氯化碳除致急性肝損傷外,反復(fù)多次的刺激可導(dǎo)致慢性肝損傷的發(fā)生,主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞再生和肝纖維化。臨床研究表明,四氯化碳是引起人類(lèi)肝損害的劇毒類(lèi)化學(xué)藥物。 原理:是CCl4進(jìn)入機(jī)體后在肝內(nèi)活化成自由基(.CCl和.00Cl3),后者可直接損傷質(zhì)膜,啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,破壞肝細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)等,造成肝

5、細(xì)胞變性壞死。 方法：一般采用60%CCI4橄欖油溶液給雌性SD大鼠以0.3ml/100g體重皮下注射,每周2次,共12周,肝功能檢查模型組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素均較對(duì)照組明顯升高,血清白蛋白水平則明顯下降,PC、LN、HA含量測(cè)定較對(duì)照組均顯著增高,病理組織學(xué)證實(shí)造模組大鼠有典型的假小葉形成,纖維間隔增寬,形成肝纖維化。模型特點(diǎn)： CCl4進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后,可直接進(jìn)肝細(xì)胞,使肝細(xì)胞變 性、壞死,誘導(dǎo)肝纖維化的形成。造模途徑多樣、簡(jiǎn)便、病理特征穩(wěn)定可靠、造模時(shí)間短,已廣泛用于研究肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞及分子機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志物與組織病理的相關(guān)性及抗纖維化物質(zhì)的藥效評(píng)價(jià)。 缺點(diǎn)是對(duì)于相同的CCl4處理,不

6、同動(dòng)物出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和肝纖維化的程度個(gè)體差異較大,導(dǎo)致不一致的組織 學(xué)和病理生理學(xué)表現(xiàn)。此外,CCl4的肝毒性作用迅速而劇烈,若劑量掌握不當(dāng),動(dòng)物死亡率很高。二甲基亞硝氨(DMN)誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型：原理： DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。大鼠染毒后肝內(nèi)小葉炎性細(xì)胞浸潤(rùn),出血性壞死。在肝內(nèi)形成中心-中心纖維間隔或中心-門(mén)脈性纖維間隔。方法： 用SD大鼠按10 mg/kg的劑量,給予1%DMN生理鹽水稀釋液,腹腔注射10次,模型組大鼠均形成肝纖維化或早期肝硬化。模型特點(diǎn)： 該模型造模周期短,大鼠死亡率低,肝纖維化形成也相對(duì)穩(wěn)定。在評(píng)價(jià)藥物對(duì)伴凝血障礙、纖溶亢進(jìn)的慢性肝病致纖維化的防治方面

7、是一個(gè)比較理想的模型。 缺點(diǎn)是小劑量不易形成肝纖維化,大劑量又容易形成肝細(xì)胞壞死后纖維化,劑量不容易掌握。膽汁性肝纖維化動(dòng)物模型:原理： 通過(guò)結(jié)扎膽管或注入硬化劑等方法人為地造成肝外膽道梗阻,從而引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、 膽道內(nèi)壓力增高,由于肝內(nèi)血管受到擴(kuò)張膽管的壓迫及膽外 滲,肝細(xì)胞發(fā)生缺血和壞死,纖維組織增生向膽管伸展,包繞肝小葉,形成肝纖維化。方法： 對(duì)雌性Wistar大鼠采用膽管結(jié)扎與切斷和逆行性注入N-丁基-2氰基丙烯酸鹽膽管粘堵的方法導(dǎo)致膽管阻塞,建立肝纖維化模型。模型特點(diǎn)： 采用膽總管結(jié)扎的方法可在狗、大鼠、猴等動(dòng)物中制作出實(shí)驗(yàn)性膽汁性肝纖維化肝硬化模型,被認(rèn)為是一種

8、能模擬人肝纖維化的較理想動(dòng)物模型,主要用于考察藥物的直接抗纖維化作用及用于篩選非創(chuàng)傷性肝纖維化血清指標(biāo)等的研究。 該模型主要特點(diǎn)是成型快、炎癥反應(yīng)輕、肝細(xì)胞壞死不明顯、自發(fā)逆轉(zhuǎn)率低、實(shí)驗(yàn)指標(biāo)穩(wěn)定。乙醇法：原理： 肝臟是乙醇代謝的主要場(chǎng)所,90%以上的乙醇在肝臟通過(guò)乙醇脫氫酶(ADH)和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(MEOS)進(jìn)行氧化代謝,乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)通路均可產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物乙醛。乙醛通過(guò)多種途徑損害肝臟的結(jié)構(gòu)和功能,直接刺激膠原蛋白質(zhì)的合成,從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。方法： 國(guó)外已經(jīng)創(chuàng)建成型的有Lieber-Decarli模型 Tsukamoto-French模型和Lieber-De

9、carli液體飼料加輔劑模型。模型特點(diǎn)： 國(guó)內(nèi)學(xué)者多在喂飼料的同時(shí)進(jìn)行酒精灌胃;還有在灌酒精的同時(shí)加吡唑以延緩酒精在肝臟代謝,造成與人相近的動(dòng)物模型。 該方法的優(yōu)點(diǎn)是成功率高、方便、價(jià)格低廉、模型穩(wěn)定。 缺點(diǎn)是灌胃量難以保證完全一致,加入輔料造模與人的生理情況不符。免疫性肝纖維化模型-刀豆素蛋白A法：原理： 是引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答,在肝臟門(mén)脈匯管區(qū)形成免疫復(fù)合物沉積,由沉積的免疫復(fù)合物引起局部炎癥反應(yīng),進(jìn)一步刺激膠原的增生而造成肝組織纖維化。方法： 將小鼠經(jīng)尾靜脈注射12.5 mg/kg劑量的1 mol/L刀豆素蛋白A,每周1次,連續(xù)6周。模型特點(diǎn)： 該方法所產(chǎn)生肝纖維化系免疫損傷所致,有利于從免

10、疫學(xué)角度探討發(fā)病機(jī)制及評(píng)價(jià)藥物。 與其他肝纖維化動(dòng)物模型相比較,Con A誘導(dǎo)的肝纖維化模型的方法成功率較高,動(dòng)物死亡率較低,方法簡(jiǎn)便易行。 另外，免疫性肝纖維化模型的建立目前常使用的異種血清有豬血清、牛血清、人血清、血吸蟲(chóng)血清等。豬血清以其中的白蛋白作為異種抗原物質(zhì)，通過(guò)免疫反應(yīng)活化枯否細(xì)胞而誘導(dǎo)發(fā)生肝纖維化。形態(tài)學(xué)和免疫組化顯示，免疫復(fù)合物在血管和連接組織沉積先于肝纖維化的發(fā)生，而肝細(xì)胞無(wú)顯著改變。豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化與人類(lèi)肝纖維化的原因有一定相似之處，纖維化形成率雖不太高，但纖維化持久，停止注射3個(gè)月，對(duì)先前形成的肝組織改變無(wú)影響，在研究肝纖維化產(chǎn)生機(jī)制和篩選抗肝纖維化藥物方面有一

11、定的優(yōu)勢(shì)。因此，豬血清反復(fù)腹腔注射模型一直用于研究吞噬細(xì)胞、貯脂細(xì)胞與肌纖維變性細(xì)胞在肝纖維化中的作用及肝纖維化過(guò)程中微循環(huán)的改變。其他： 病毒性肝纖維化模型：給櫻桃谷鴨脛靜脈注射鴨乙肝病毒(DHBV)血清,同時(shí)給予低蛋白質(zhì)、低維生素、高脂飼料喂養(yǎng), 85 d后出現(xiàn)輕度肝纖維增生。由DHBV復(fù)制的肝纖維化模型的優(yōu)點(diǎn)是與人類(lèi)肝炎病毒引起的肝纖維化接近,但與鴨種來(lái)源、DHBV接種量、接種次數(shù)、給藥途徑及間隔時(shí)間等因素有關(guān)。缺點(diǎn)是造模時(shí)間長(zhǎng),影響因素偏多,不易控制。 血吸蟲(chóng)法：用血吸蟲(chóng)尾蚴來(lái)制備肝纖維化模型。實(shí)驗(yàn)第6周可見(jiàn)肝臟中心靜脈的變形壞死,門(mén)脈區(qū)網(wǎng)狀蛋白聚集并伸入到肝小葉,并最終形成肝纖維化。

12、此種模型可用于血吸蟲(chóng)病性肝硬化的藥物治療研究,但不適宜用于其他人類(lèi)肝纖維化的研究。顯微鏡下放大40倍的血吸蟲(chóng)尾蚴： 營(yíng)養(yǎng)法(高脂飲食法)：給大鼠含有膽固醇的高脂飼料后，一定時(shí)間就可誘發(fā)體重超重、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝。 方法：以基礎(chǔ)飼料+100g/kg豬油+ 20g/kg膽固醇喂養(yǎng)大鼠12wk，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)高膽固醇血癥、中重度脂肪肝伴以小葉內(nèi)為主的肝臟炎癥壞死，從而建立了高脂飼料誘發(fā)的大鼠高脂飲食模型。特點(diǎn)： 此大鼠脂肪性肝炎伴隨肝纖維化模型與人類(lèi)的脂肪性肝炎肝纖維化在生化、病理等方面較為接近。且該造模方法簡(jiǎn)便，僅需含有一定比例的豬油和膽固醇的高脂飼料，造模過(guò)程中大鼠死亡率為零。 不足

13、之處是，這些動(dòng)物模型一般無(wú)明顯的脂肪性肝炎，更少出現(xiàn)肝纖維化，除非有內(nèi)毒素等“二次打擊”的作用。 復(fù)合法：由于單因素制備動(dòng)物模型的周期長(zhǎng),成模比率低。單一因素可能在加大劑量時(shí)不但不產(chǎn)生肝纖維化,反而增加動(dòng)物死亡率。因此部分學(xué)者采用復(fù)合因素制備模型。 人類(lèi)的肝纖維化是一個(gè)復(fù)合因素作用的結(jié)果,因此在選擇肝纖維化動(dòng)物模型的時(shí)候,首先應(yīng)選擇復(fù)合因素造模方法;其次是選擇成模方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),復(fù)制性高,成模比例高,穩(wěn)定的方法。復(fù)合模型的建立： （1）先用苯巴比妥誘導(dǎo)肝酶 （2）2周后加用CCl4建立肝纖維化模型,皮下注射四氯化碳花生油溶液、高脂飲食、酒精等。此方法造模時(shí)間短,肝纖維化形成率較高,死亡率較低。

14、 （3）聯(lián)合應(yīng)用血管緊張素每100g體重0.3mg,分2次腹腔注射及CCI4皮下注射每100g體重0.3ml,每3天1次,首劑加倍,結(jié)果使原先單獨(dú)使用CCl4需時(shí)8周的肝纖維化在4周內(nèi)完成,加速了大鼠肝纖維化進(jìn)程,縮短了造模時(shí)間。 一個(gè)理想的肝纖維化動(dòng)物模型應(yīng)該符合以下 條件: 與人類(lèi)肝纖維化疾病的基本病變特征相似; 病變有一定發(fā)展過(guò)程，即明顯分期，以及病程發(fā)展存在一個(gè)可逆與不可逆的階段性演進(jìn)過(guò)程； 形成率高，死亡率低，重復(fù)性好; 造模方法簡(jiǎn)便易行和動(dòng)物易獲得，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。中醫(yī)癥候動(dòng)物模型： 中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為肝纖維化多是濕熱、疫毒、痰瘀、飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞逸失當(dāng)、正虛所致，對(duì)肝纖維化的主要病理

15、認(rèn)識(shí)多數(shù)建立在“血瘀”基本病機(jī)之上，認(rèn)為血瘀是其主要病機(jī),治療也以疏肝化瘀通絡(luò)貫穿始終。 中醫(yī)證候動(dòng)物模型所揭示的是中醫(yī)學(xué)的基本內(nèi)涵,所以復(fù)制時(shí)應(yīng)以中醫(yī)病因、病機(jī)、臟象理論為依據(jù),反映中醫(yī)學(xué)的實(shí)質(zhì)。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下,從病因、病機(jī)入手,復(fù)制中醫(yī)證候動(dòng)物模型是切實(shí)可行的。如風(fēng)、寒、濕性復(fù)制痹證動(dòng)物模型,慢性疲勞復(fù)制虛證動(dòng)物模型,苦寒瀉下復(fù)制的脾虛證動(dòng)物模型,助陽(yáng)傷陰復(fù)制的陰虛證動(dòng)物模型,寒盛傷陽(yáng)陰復(fù)制的陽(yáng)虛證動(dòng)物模型,膏粱厚味傷脾加大腸桿菌感染復(fù)的溫病濕熱證動(dòng)物模型等等基本上都是成功的范例。 在肝臟疾病中，利用不可預(yù)知的多種應(yīng)激隨機(jī)組合方法，建立中醫(yī)肝郁證大鼠模型。 目前尚缺乏依據(jù)中醫(yī)病因病

16、機(jī)理論建立的肝纖維化動(dòng)物模型。由于“證候”概念寓意深刻,包含的信息量龐雜,是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,具有復(fù)雜性、模糊性和不確定性,因此證的研究受到很大的局限,與之相關(guān)的肝纖維化的證候動(dòng)物模型的研究也受到限制。 總之,理想的肝纖維化模型應(yīng)具有人類(lèi)肝纖維化的基本形態(tài)特征,其病理改變呈階段性進(jìn)展,模型制作具有可重復(fù)性以及低死亡率等到特點(diǎn)。今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)肝纖維化動(dòng)物模型研究,并結(jié)合中醫(yī)理論尋找符合“證”本質(zhì)的動(dòng)物模型,從而促進(jìn)中醫(yī)藥抗肝纖維化的研究。體外模型 肝臟細(xì)胞分為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞又可分為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、 枯否氏細(xì)胞、Ito細(xì) 胞和隱窩細(xì)胞。它們?cè)谡麄€(gè)肝臟細(xì)胞中 (除外膽管細(xì)胞和血管細(xì)胞

17、)所占的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和體積百分比見(jiàn)下表。大鼠肝臟細(xì)胞的種類(lèi)和比例細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞數(shù)（）體積（體積（）肝細(xì)胞6092.2血竇內(nèi)皮細(xì)胞193.3枯否細(xì)胞152.5肝星狀細(xì)胞51.7隱窩細(xì)胞10.3 肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（間質(zhì)細(xì)胞）在肝纖維化的發(fā)病過(guò)程中起到很重要的作用，其中以肝星狀細(xì)胞的作用更為關(guān)鍵。建立這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)，有助于研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和影響因素，也可作為體外細(xì)胞模型觀察藥物對(duì)肝纖維化的影響。 因此，分離和培養(yǎng)這些細(xì)胞對(duì)于在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平上研究肝纖維化是及其重要的。下面介紹細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法。肝星狀細(xì)胞肝星狀細(xì)胞枯否細(xì)胞枯否細(xì)胞血竇內(nèi)皮細(xì)胞血竇內(nèi)皮細(xì)胞 肝星狀細(xì)胞肝星狀細(xì)胞( (

18、hepatic stellate cellhepatic stellate cell，HSC)HSC)的分離與培養(yǎng)的分離與培養(yǎng)（一）Nycodenz密度梯度離心分離法（文獻(xiàn)報(bào)道較多） Sprague-Dawdey大鼠或Wistar大鼠，體重400g以上為宜。用戊巴妥鈉腹腔麻醉(30mg/kg），用5 碘酒和75酒精消毒皮毛。在潔凈臺(tái)中剪開(kāi)腹部皮膚和肌肉，行門(mén)靜脈插管輸入D-Hanks液，pH7.3,同時(shí)剪斷下腔靜脈，并將肝臟游離取下，在體外灌洗肝臟直至洗清肝臟中的血液。當(dāng)肝臟中的血液洗清后，從門(mén)靜脈循環(huán)灌注還酶的D-Hanks液，37，pH7.4-7.5。 灌注液中含型膠原酶0.05 （W/V

19、)、蛋白酶E0.1 （W/V）、HEPES10mmol/L/、青霉素100U/ml、鏈霉素100g/ml、灌流速度為20-30ml/min,共消化肝臟約20-30min。停止灌注后用鑷子撕開(kāi)肝包膜，輕柔地鈍性粉碎肝臟后再第二次消化肝臟，消化液為：Hanks液中含型膠原酶0.05 （W/V)、蛋白酶 E 0.02， HEPES 10mmol/L，37，pH7.4，振動(dòng)消化20min,其間補(bǔ)充少量無(wú)菌的5NaHCO3 ,以免pH過(guò)低影響消化結(jié)果。第二次消化結(jié)束后，分別用80目和120目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。 濾液離心450g， 7min,細(xì)胞沉淀在Hanks液中懸浮，體積10ml，與20ml18 （

20、W/V）、的Nycodenz混勻。此時(shí)將30ml與Nycodenz混合的細(xì)胞懸液分置數(shù)個(gè)離心管中，上覆Hanks液，進(jìn)行密度梯度離心1450g，17min.離心后取界面細(xì)胞，在DMEM培養(yǎng)基中懸浮，再次離心450g，7min,洗去Nycodenz。將細(xì)胞沉淀重懸于含胎牛血清20 的DMEN和IMDM的混合培養(yǎng)基中（V/V=1:1）?？捎锰ヅ嗡{(lán)染色判斷細(xì)胞的存活率并計(jì)算產(chǎn)率。一般體重400g以上的大鼠肝星狀細(xì)胞產(chǎn)率約1-10）107個(gè)細(xì)胞，存活率95%。（二）Stractan（阿拉伯半聚乳糖）密度梯度離心法 Stractan的制備：將450g粗制的Stractan粉劑溶于400ml蒸餾水。在4

21、下分別將上述溶液用各900g的Amberlite 1RA-120陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和1RA-410陰離子交換樹(shù)脂攪拌30min以去除離子。然后經(jīng)過(guò)濾漏斗除去溶液中的離子交換樹(shù)脂。 Stractan溶液與BSG緩沖液2:1混合，最終經(jīng)添加固體NaCl將溶液的滲透壓調(diào)至290-295mOsmol/L；pH為7.4， Stractan的貯存液在35-40 的濃度范圍，于-20 保存。 具體的分離方法是用75mlL-15鹽溶液原位灌洗肝臟，10ml/min，37 ，然后用100mlHanks改良的DMEM其中含0.2 蛋白酶E灌注，再循環(huán)灌注含0.015 的膠原酶的H/DMEM約25min。第二次消化肝臟

22、時(shí)省去了膠原酶，用100ml H/DMEM含0.02 蛋白酶E和10g/mlDNase 37 下振蕩消化30min左右。細(xì)胞懸液用紗布過(guò)濾，離心500g，7min總共三次以洗滌細(xì)胞。洗液為無(wú)Ca2+、Mg2+的MEM-E。最終細(xì)胞懸浮在25mlMEM-E中，分別加樣到Stractan梯度上。 Stractan由經(jīng)超濾消毒的4個(gè)濃度梯度組成：6、8、12和20 ，每一濃度有1.5ml，密度分別為1.053、1.058、1.080和1.111。加有細(xì)胞懸液的梯度于25 離心20000r/min,30min。離心后肝星狀細(xì)胞在懸液（ MEM-E）和6 Stractan之間的界面收集，在MEM-E中離

23、心500g，7min洗滌。最終懸浮于各含10 的牛與血清的M199培養(yǎng)基中，并用該培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。該法分離的肝星狀細(xì)胞產(chǎn)率為（12.2 1.7） 106，存活率96 ，純度99。（三）Metrizamide密度梯度離心分離法 該方法與Nycodenz密度梯度離心分離法酷似，不同之處是在密度梯度離心時(shí)，分離介質(zhì)由Nycodenz換成Metrizamide（8，13和18）， Metrizamide溶于無(wú)NaCl的Geys緩沖液。離心速度為700 g，17min。肝星狀細(xì)胞在最上層收集，與適量的Hanks混合，離心洗去Metrizamide。 肝星狀細(xì)胞的培養(yǎng)一般無(wú)特殊需求：在37 含5CO2、9

24、5 空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液為DMEM /IMDM（V/V=1:1）或M-199均可，pH7.2-7.4。原代培養(yǎng)時(shí)，血清濃度要求較高，為20 ，最好是進(jìn)口胎牛血清。細(xì)胞經(jīng)傳代后，培養(yǎng)液中的血清可減至10 。肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，第一次換液為細(xì)胞接種后的48h，以后視生長(zhǎng)情況48-72h換一次液。細(xì)胞接種密度為（1-2）105/cm2。 肝星狀細(xì)胞鑒定： 形態(tài)學(xué) 在光鏡下，原代肝星狀細(xì)胞呈星形或多邊形，有數(shù)個(gè)突起，胞漿豐富，內(nèi)含脂滴。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，細(xì)胞活化并增殖，胞內(nèi)脂滴逐漸減少，有的細(xì)胞變?yōu)樗笮?，如同成纖維細(xì)胞。透射鏡下，原代早期的肝星狀細(xì)胞胞漿內(nèi)含大量脂滴，傳代后胞漿中脂滴明顯減少，有較

25、多的微絲出現(xiàn)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)。 VitA自發(fā)熒光 用熒光顯微鏡，在328nm的紫外光激發(fā)下，新分離或早期原代培養(yǎng)的HSC能發(fā)出藍(lán)綠色的自發(fā)熒光，并在數(shù)秒內(nèi)減退。 胞漿中desmin(結(jié)蛋白）染色陽(yáng)性 在培養(yǎng)皿中放入洗凈消毒的小玻片，將HSC接種到平皿內(nèi)。待細(xì)胞貼附后，取出玻片，用PBS沖洗，干燥后用丙酮/氯仿（V/V=1:1）固定20min,再干燥。與濕潤(rùn)的環(huán)境和室溫下，與desmin抗體或抗血清培育30min。用PBS洗滌三次，每次5min。玻片再與熒光標(biāo)記的第二抗體培育30min。最后用PBS洗3次，用50%甘油的PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照用與抗體稀釋度一致的正常大鼠血清或兔

26、血清代替抗desmin抗體或抗血清。此法是鑒定肝星狀細(xì)胞最可靠的重要方法。A AB BC CD DHSCsHSCs的培養(yǎng)與鑒定的培養(yǎng)與鑒定 A A 光鏡下新鮮分離的光鏡下新鮮分離的HSCsHSCs ( (100) B 100) B 光鏡下培養(yǎng)光鏡下培養(yǎng)7d7d的的HSCsHSCs （100100） C C VitAVitA自發(fā)熒光自發(fā)熒光 D D 光鏡下光鏡下DesminDesmin染色陽(yáng)性染色陽(yáng)性 枯否細(xì)胞（枯否細(xì)胞（kupfferkupffer cells) cells)的分離及培養(yǎng)的分離及培養(yǎng) （一）Stractan（阿拉伯半聚乳糖）密度梯度離心法 kupffer細(xì)胞的分離方法與HSC相

27、似，主要是用密度梯度離心分離，膠原酶消化肝臟。前文以 Stractan為介質(zhì)分離HSC，當(dāng)經(jīng)密度梯度離心20000r/min,30min后，在8%-12% Stractan的界面收集kupffer細(xì)胞，用MEM-E洗滌細(xì)胞，離心500g，7min。最后細(xì)胞懸浮于Medium199中，其中含20%血清。 將細(xì)胞接種于60mm未經(jīng)包被的塑料培養(yǎng)皿中，37 下20min后吸去未吸附貼壁得細(xì)胞，并用L-15鹽溶液輕柔漂洗一下已貼壁的細(xì)胞，隨后平皿中加入新的含20%血清的M-199培養(yǎng)基。24h后，用0.5%胰蛋白酶加0.02%EDTA于37 消化細(xì)胞3min，輕輕吸去已消化下來(lái)的細(xì)胞，其余貼壁細(xì)胞即k

28、upffer細(xì)胞重新用M-199含20%血清培養(yǎng)，沒(méi)24h換液。此法得到的細(xì)胞產(chǎn)率為（7.2-2.2） 106，純度為95.4 % 2.7%，存活率96.9 % 5.4 %。（二）Percoll密度梯度離心法 大鼠經(jīng)麻醉后，門(mén)靜脈灌注D-Hanks液4min，流速40ml/min。隨后用含0.05%的型膠原酶的L-15培養(yǎng)基灌注肝臟8min，流速25ml/min。將肝臟剪開(kāi)并用鑷子將肝臟的細(xì)胞分離。細(xì)胞懸液離心40g，3min，將上清液收集以密度梯度離心。將細(xì)胞懸液與Percoll混合，離心2800g，5min。在密度為1.06的層中收集細(xì)胞。細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，密度為2 106/平皿。培養(yǎng)基

29、為L(zhǎng)-15medium，含10%胎牛血清。該法分離得到的大鼠kupffer細(xì)胞純度95%，存活率95%。 Kupffer細(xì)胞的相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞呈多角形，大小約10-15 m，細(xì)胞核呈特有的腎形。 （1）觀察Kupffer細(xì)胞的吞噬功能 培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞在L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含10%胎牛血清和0.0042%聚苯乙烯微珠，該珠直徑為1m。培育60min，37 。用上述培養(yǎng)基洗滌三次，然后再倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞內(nèi)吞噬的塑料珠球。 （2）細(xì)胞的過(guò)氧化物酶染色 將細(xì)胞在含二氨基聯(lián)苯胺和H2O2的培養(yǎng)基中培育，細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶能分解雙氧水產(chǎn)生氧，與二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)顯色。 K

30、CsKCs細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定. A: . A: 新分離的新分離的KCsKCs細(xì)胞細(xì)胞, , 呈圓形呈圓形, , 大小基本一致大小基本一致( (200); B: 200); B: 培養(yǎng)培養(yǎng)72 h72 h后后, , 細(xì)胞體積增大細(xì)胞體積增大, , 延伸成不規(guī)則形延伸成不規(guī)則形, , 伸出偽足伸出偽足( (200); C: 200); C: KCsKCs吞噬碳素顆粒吞噬碳素顆粒( (200); D: 200); D: 肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞離心前肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞離心前ED2ED2染色染色( (400); E: 30% 400); E: 30% PercollPercoll層細(xì)胞層細(xì)胞ED2ED2染色染

31、色( (400); F: 30% 400); F: 30% PercollPercoll層與層與60% 60% PercollPercoll層之間的細(xì)胞層之間的細(xì)胞ED2ED2染色染色( (400).400).（曾曾 仲仲, , 黃漢飛黃漢飛, , 宋宋 飛等飛等. .體外灌注體外灌注法分離大鼠肝臟法分離大鼠肝臟KupfferKupffer細(xì)胞及原代培養(yǎng)細(xì)胞及原代培養(yǎng)J J. .世界華人消化雜志世界華人消化雜志, 2009, 17(25): 2550-, 2009, 17(25): 2550-2554.2554.） 血竇內(nèi)皮細(xì)胞（血竇內(nèi)皮細(xì)胞（sinusoidal sinusoidal end

32、othelial cells)endothelial cells)的分離及培養(yǎng)的分離及培養(yǎng) 血竇內(nèi)皮細(xì)胞可在用Stractan為介質(zhì)密度梯度分離大鼠Kupffer細(xì)胞的同時(shí)，在12%-20%Stractan的界面處得到血竇內(nèi)皮細(xì)胞。此時(shí)獲得的細(xì)胞雖大部分為內(nèi)皮細(xì)胞，還有少量Kupffer細(xì)胞和紅細(xì)胞及白細(xì)胞。去除這些細(xì)胞的方法：細(xì)胞在含血清的MEM-E培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，經(jīng)24h后換液，即可除去不貼壁的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，再過(guò)24h后，貼壁的細(xì)胞用L-15溶液或PBS洗滌兩次，用0.125%胰酶和 0.005%EDTA消化3min。消化下來(lái)的即為血竇內(nèi)皮細(xì)胞，重新再20%血清的培養(yǎng)基中懸浮，接種到新

33、的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。未被胰酶消化的細(xì)胞為Kupffer細(xì)胞。 血竇內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定： 因子免疫熒光染色 方法與desmin免疫熒光染色鑒定HSC極為相似，僅一抗由抗desmin抗血清改為兔抗人第因子多克隆抗體。 因子染色為陽(yáng)性者為內(nèi)皮細(xì)胞。 倒置相差顯微鏡下培養(yǎng)不同時(shí)間的倒置相差顯微鏡下培養(yǎng)不同時(shí)間的 SEC( SEC( 200)200)A. A. 培養(yǎng)培養(yǎng)2h2h的的SEC SEC 呈小圓形呈小圓形, ,大小均勻大小均勻( (200) 200) B.B.培養(yǎng)培養(yǎng)6h6h的的SECSEC出現(xiàn)典型形態(tài)出現(xiàn)典型形態(tài)( ( 200)200)C. C. 培養(yǎng)培養(yǎng)12h12h的的SECSEC呈網(wǎng)狀排列呈網(wǎng)狀排列( (200) D.200) D.培養(yǎng)培養(yǎng)80h80h的的SECSEC成團(tuán)排列成團(tuán)排列 , ,完全伸展完全伸展( ( 200)200)肝星狀細(xì)胞與其他肝臟細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞與其他肝臟細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng) 將HSCs與其他肝臟細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的目的是為了觀察研究細(xì)胞間的相互作用和影響。從狹義上講聯(lián)合培養(yǎng)僅是指兩種細(xì)胞在同一培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，它們之間是相通的，從廣義上講兩種細(xì)胞雖在獨(dú)自的培養(yǎng)容器中單獨(dú)培養(yǎng)，但將其中