流感禽流感實(shí)驗(yàn)室診療與新技術(shù)應(yīng)用新進(jìn)展

1、流感禽流感實(shí)驗(yàn)室診療與新技術(shù)應(yīng)用新進(jìn)展流感病毒病原學(xué)2 流感病毒：正粘病毒科，流感病毒屬。 結(jié)構(gòu)分3部分：包膜、衣殼和核心。 78個(gè)基因組片段：PB2，PB1，PA， HA（血凝素）， NP，NA（神經(jīng)氨酸酶），MP，NS。 據(jù)NP和MP分型： A型甲型流感病毒 B型乙型流感病毒 C型丙型流感病毒流感病毒病原學(xué)3 （1）血凝素(Hemagglutinin HA) ：（柱形） 凝集紅細(xì)胞血凝現(xiàn)象，用于鑒定病毒 吸附宿主細(xì)胞與受體結(jié)合（侵入細(xì)胞的關(guān)鍵） 抗原性相應(yīng)抗體，有中和作用 易變異（分亞型） （2）神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase NA）：（蘑菇形） 參與病毒釋放，促進(jìn)病毒擴(kuò)散 抗原性

2、 易變異（分亞型） （3）病毒變異：抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變親脂類(lèi)病毒或中等大小的病毒親脂類(lèi)病毒或中等大小的病毒（如：（如：HSV,CMV,RSV,HIV,HBV）細(xì)菌繁殖體（如：金葡，綠膿）細(xì)菌繁殖體（如：金葡，綠膿）真菌（如，念珠菌屬，曲霉屬）真菌（如，念珠菌屬，曲霉屬）非脂類(lèi)或小病毒（如脊非脂類(lèi)或小病毒（如脊髓灰質(zhì)炎病毒髓灰質(zhì)炎病毒 ,柯薩奇病毒）柯薩奇病毒）分枝桿菌（如分枝桿菌（如TB，M.terrae ）Cryptosporidium parvum 隱孢子蟲(chóng)隱孢子蟲(chóng) 細(xì)菌芽孢細(xì)菌芽孢Prions敏感敏感耐受耐受低效中效 高 效滅菌滅菌（高，延時(shí)）（高，延時(shí)）消毒劑水平消毒劑水平氣體滅菌氣體

3、滅菌蒸汽滅菌蒸汽滅菌 理化特性：病毒理化特性：病毒對(duì)乙醇、碘伏、對(duì)乙醇、碘伏、碘酊敏感；對(duì)熱碘酊敏感；對(duì)熱敏感，敏感，56305630分分鐘可滅活。鐘可滅活。流感病毒病原學(xué)5 宿主范圍：人、豬、馬、禽類(lèi)等 宿主界限不十分嚴(yán)格，在一定的條件下可突破種間屏障，在不同種間傳播 動(dòng)物流感同人類(lèi)流感關(guān)系密切。豬是儲(chǔ)存宿主，也可能是“混合器”流感病毒病原學(xué)6 培養(yǎng)特點(diǎn) 細(xì)胞、動(dòng)物 致病性和免疫性病毒侵入人體后在呼吸道黏膜和肺部繁殖，病毒和其代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液引起相應(yīng)的臨床癥狀。 引起體液和細(xì)胞免疫流感監(jiān)測(cè)目的 （一）監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)水平和流行動(dòng)態(tài)； （二）及時(shí)發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并作出預(yù)警； （三）為全球及我國(guó)流感

4、疫苗毒株的預(yù)測(cè)和推薦提供依據(jù)。流感監(jiān)測(cè)內(nèi)容 （一）流感樣病例監(jiān)測(cè) （二）流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè)流感樣病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本采集 采集對(duì)象： 流感樣病例流感樣病例 發(fā)熱（體溫發(fā)熱（體溫3838），伴咳嗽或咽痛之一者），伴咳嗽或咽痛之一者 采集時(shí)間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集，最好是24h內(nèi) 采集地點(diǎn)：國(guó)家級(jí)流感樣病例監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院 采集數(shù)量：根據(jù)就診ILI病例數(shù)的多少，每家哨點(diǎn)醫(yī)院每周至少采集20份流感樣病例的標(biāo)本(根據(jù)流行季節(jié)、流行強(qiáng)度、防控工作需要實(shí)時(shí)調(diào)整）暴發(fā)疫情標(biāo)本采集 （1）1周內(nèi)，在同一學(xué)校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門(mén)診留觀病例）；

5、或發(fā)生2例及以上有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的死亡病例； （2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一鄉(xiāng)或街道）1周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例異常增多。 每一起暴發(fā)疫情一般應(yīng)當(dāng)采集10份咽、鼻拭子標(biāo)本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應(yīng)當(dāng)全部采樣）。采集標(biāo)本類(lèi)型 常規(guī)常規(guī)特殊特殊咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液、含漱液 血清 呼吸道灌洗液 肺組織活檢標(biāo)本 尸檢標(biāo)本采樣液 常用的采樣液有：的Hanks液或MEM； 標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４?，同時(shí)加入抗菌素（入慶大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ）咽拭子采集咽拭子咽拭子 用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后

6、壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。 注意：采樣前1h內(nèi)不要進(jìn)食和飲水，采樣液中嚴(yán)禁加入抗生素標(biāo)本的保存與運(yùn)送 標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下，盡快（哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)48小時(shí)疫情24小時(shí)內(nèi)）運(yùn)送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室 未能送至實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)置-70或以下保存，一周內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室 凍存的標(biāo)本，盡量避免其反復(fù)凍融，在冷藏條件下送到實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室生物安全要求l季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。l流感病毒分離鑒定及其它檢測(cè)過(guò)程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過(guò)程必須在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里操作。l用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)可以在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)本的接收 接收標(biāo)本時(shí)必須核對(duì)送檢

7、表 流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員接到標(biāo)本后，24小時(shí)內(nèi)將“流感/人禽流感監(jiān)測(cè)病例標(biāo)本原始登記送檢表”（表2）錄入到“監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”標(biāo)本的處理 標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行處理，未加抗菌素的加入適量的抗菌素。 將原始標(biāo)本一分為三份，一份（1ml）用于MDCK細(xì)胞接種，一份（1ml）用于雞胚接種，一份（1ml）保存待復(fù)核。（根據(jù)檢測(cè)程序?qū)崟r(shí)調(diào)整）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分子診斷RT-PCR、real-time RT-PCR主要選用的基因片段：M基因-檢測(cè)A型流感，NS基因-檢測(cè)B型流感， HA基因-檢測(cè)禽流感、季節(jié)流感H1/H3以及其他亞型病毒分離和血凝抑制試驗(yàn)可用MDCK細(xì)胞和SPF雞胚分離流感病毒，對(duì)于高致病

8、性禽流感病毒分離要求BSL-3實(shí)驗(yàn)室；可以診斷感染，但無(wú)法為臨床診斷及時(shí)提供結(jié)果?？焖僭嚰垪l法一些商用快速檢測(cè)可以區(qū)分A和B型流感病毒，但是檢測(cè)季節(jié)性流感病毒的靈敏度不佳。因此，快速檢測(cè)陰性結(jié)果可能是假陰性，不能作為禽流感感染的最后診斷。 免疫熒光法免疫熒光試驗(yàn)可以區(qū)分A和B型流感病毒 。免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果取決于臨床標(biāo)本的質(zhì)量，操作技能。因此，免疫熒光試驗(yàn)陰性結(jié)果可能是假陰性，不能作為禽流感感染的最后診斷。 血清學(xué)季節(jié)性流感檢測(cè)流程臨床標(biāo)本采集接種MDCK細(xì)胞接種雞胚紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，鑒定病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性PCR鑒定人感染高致病性禽流感標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程圖呼吸道、尸檢標(biāo)本

9、、其它標(biāo)本病毒分離和鑒定標(biāo)本采集對(duì)象血清標(biāo)本HI試驗(yàn)、微量中和試驗(yàn)、單擴(kuò)溶血報(bào)告采集檢測(cè)第三份血清雙份血抗體滴度4倍增長(zhǎng)核酸檢測(cè)：RT-PCR或Real-Time PCR，引物至少應(yīng)包括A、兩對(duì)H5再次采樣再次檢測(cè)按照人流感監(jiān)測(cè)方法分離鑒定可疑A及兩對(duì)H5陽(yáng)性陽(yáng)性?xún)蓪?duì)H5陰性陰性擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定 雙份血抗體滴度無(wú)4倍增長(zhǎng)報(bào)告報(bào)告核酸檢測(cè)的原理 核酸提取的原理 PCR的原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理核酸提取的原理 無(wú)論是從真核細(xì)胞或是從細(xì)菌病毒中提取核酸，涉及的基本原理是使細(xì)胞膜或細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，再用某些有機(jī)溶劑抽提使核酸分離或使核酸吸附于某些顆粒的表面，再進(jìn)行沉淀或洗脫，

10、從而獲取核酸。核酸提取核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit1）在1.5ml 離心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 2）取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）140ul加入上述離心管中（糞便標(biāo)本用10懸液的上清），震蕩15s，室溫放置10min。 3）稍離心后，加入560ul無(wú)水乙醇，震蕩15s。4）將Viral RNA Mini spin柱子取出，將步驟3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm離心1min。棄離心液。5）重復(fù)步驟4。6）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm離心

11、1min。棄套管及其離心液。7）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm離心3min，棄套管及其離心液。8）將吸附柱放入一新的1.5ml 離心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室溫靜置13分鐘，8000rpm離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即實(shí)驗(yàn)或20以下保存。PCR技術(shù)的原理 生物體的遺傳物質(zhì)：核酸（DNA/RNA） 堿基序列的長(zhǎng)度和排列的順序決定了生物的多樣性。 人類(lèi)體細(xì)胞中有31億個(gè)堿基對(duì)。 除了真正雙胞胎外, 每個(gè)人的DNA是獨(dú)一無(wú)二的, 就好像指紋一樣。PCR技術(shù)的原理PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分

12、別與模板互補(bǔ)的DNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。特異性：引物序列靈敏度：擴(kuò)增100萬(wàn)倍1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2535輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍RT-PCR和real-time PCR RT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，擴(kuò)增的模板為RNA，增加RNADNA過(guò)程。 Real-time PCR：即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)

13、程。RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）熒光定量PCR 第一次使用前引物稀釋 1引物工作濃度（40M） 配制方法：（1）將新合成的引物開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100M，可作為儲(chǔ)存液。（例如：假設(shè)合成引物每管2OD，若2OD的量為9.1 nmol ，加水量為109.191l）（3）將100M的引物2.5倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為40M，可作為工作濃度。 2探針工作濃度（10/20M/） 配制方法：（

14、1）將新合成的探針管開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100M，可作為儲(chǔ)存液。（3）將100M的探針10/5倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為10/20M，可作為工作濃度。熒光定量PCR 引物和探針 稀釋好的冰凍的引物和探針進(jìn)行融化（已融的探針避光2-8可保存多達(dá)3個(gè)月，不要對(duì)探針?lè)磸?fù)凍融）； 渦旋振蕩引物和探針； 瞬時(shí)離心引物和探針，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的試劑 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在試驗(yàn)

15、過(guò)程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 試劑：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen，貨號(hào)：11732-020或11745-100） 分子級(jí)無(wú)菌蒸餾水 (無(wú)RNA酶和DNA酶) 正反向引物 (40M) 雙重標(biāo)記探針(10M)反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45 反應(yīng)體系為25ul 注：*在55 度這一步驟中要收集熒光信號(hào)（FAM）熒光PCR結(jié)果陽(yáng)性樣品熒光PCR結(jié)果陰性樣品熒光PCR結(jié)果可疑樣品病毒分離

16、-MDCK細(xì)胞3335培養(yǎng)接種流程清洗MDCK 細(xì)胞臨床采樣標(biāo)本接種細(xì)胞Hanks液清洗細(xì)胞，一般清洗2遍3335度吸附12小時(shí)Hanks液清洗細(xì)胞加入病毒生長(zhǎng)液，3335度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞病變?yōu)?+或4+時(shí)，即75100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融12次，以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無(wú)細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲 （細(xì)胞病變情況：細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落 ）根據(jù)使用的細(xì)胞瓶的大小，決定接種量，一般的小細(xì)胞瓶接種0.5ml的臨床標(biāo)本流程圖MDCK細(xì)胞病毒分離lCPE出現(xiàn)時(shí)間與感染病毒的型別、

17、毒株的差異、感染量的大小和MDCK細(xì)胞的敏感性有關(guān)l每日觀察細(xì)胞病變(CPE)l標(biāo)本接種后7天還未出現(xiàn)CPE，維持液經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，繼續(xù)盲傳12代后，HA試驗(yàn)仍為陰性者，則MDCK細(xì)胞病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去 細(xì)胞病變圖雞胚病毒分離檢卵標(biāo)本準(zhǔn)備雞胚分離方法-試劑準(zhǔn)備1) 91) 91111日齡雞胚日齡雞胚2) 2) 照蛋燈照蛋燈3) 70%3) 70%7575酒精酒精4) 1ml 4) 1ml 一次性注射器一次性注射器5) 5) 雞蛋開(kāi)孔器雞蛋開(kāi)孔器6) 6) 無(wú)菌膠布或蠟無(wú)菌膠布或蠟7) 10ml 7) 10ml 試管和試管架試管和試管架8) 10ml 8) 10ml 移液管或移液管或1

18、ml1ml移液器及無(wú)菌吸尖移液器及無(wú)菌吸尖9) 9) 無(wú)菌鑷子無(wú)菌鑷子10) 10) 無(wú)菌眼科剪無(wú)菌眼科剪雞胚分離方法-標(biāo)記雞胚 檢視標(biāo)記雞胚 用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài) 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊 胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，死胚無(wú)胎動(dòng) 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊 膜與雞胚胎的另一面形成明顯的界限 標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊的界限、胚胎頭部的位置 如果雞胚是死胚、沒(méi)有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉 接種病毒方法接種病毒方法 單腔接種 盲種雙腔接種 燈下接種 開(kāi)窗接種雞胚分離方法雞胚分離方法雞胚分離流程（1） 將標(biāo)記好的雞胚的氣室朝上放置在蛋

19、盤(pán)上，通常每個(gè)樣本接種3個(gè)雞胚 用70%75酒精消毒雞胚，在氣室端鉆孔，開(kāi)10 x6mm窗口 用注射器吸200l處理過(guò)的臨床標(biāo)本，裝上16 號(hào)針頭 從窗口中滴入無(wú)菌的液體石蠟，然后輕輕晃動(dòng)雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開(kāi)，此時(shí)在照蛋燈下即 可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的 鄂下胸前，用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可注射100l標(biāo)本。將針頭退出至 寸，將另外100 l標(biāo)本 注入雞胚尿囊腔雞胚分離流程（2）用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外的兩枚雞胚將針頭棄于合適的生物安全裝置中用消毒過(guò)的醫(yī)用膠布封口 3335oC 溫箱培養(yǎng)雞胚23

20、 天。臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天 雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚生長(zhǎng)情況，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去雞胚分離流程（3）收獲尿囊液和羊水收獲尿囊液和羊水雞胚在收獲前應(yīng)4過(guò)夜或至少放置4小時(shí)標(biāo)記15ml 無(wú)菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致用70%75酒精消毒雞胚頂部用無(wú)菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開(kāi)雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時(shí)也可以將3個(gè)雞胚的羊水合并雞胚病毒鑒定 經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，將羊水和尿囊液混合，繼續(xù)盲傳1代（72小時(shí)），如仍為陰性，則雞胚病毒分離為陰性，標(biāo)本可

21、棄去雞胚收獲HA試驗(yàn)病毒鑒定 紅細(xì)胞凝集 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)病毒鑒定流程紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)4個(gè)凝集單位配制“回滴”紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)判定流感病毒型別紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）lMDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA），確定病毒滴度l 原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能結(jié)合并）含有能結(jié)合并識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn)生凝

22、集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)紅細(xì)胞紅細(xì)胞雞雞火雞火雞豚鼠豚鼠人人 O 型 血 紅型 血 紅細(xì)胞細(xì)胞馬馬適用范圍流感和禽流感病毒流 感 和 禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒終濃度（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形狀U或V型U或V型U型U型U型孵育時(shí)間30min30min45min45min60min細(xì)胞對(duì)照細(xì)胞沉積成圓點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì) 胞 沉 積成 圓

23、點(diǎn) 狀， 傾 斜 時(shí)細(xì) 胞 向 下流 成 淚 滴狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀A(yù)HBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀釋完病毒液后加入稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液50ulPBS稀釋病毒加入配制好的紅細(xì)胞懸液充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果病毒病毒原液原液1：21：128HA： 32HA128 HA： 4紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）lHA滴度8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)；HA滴度8者，繼續(xù)在敏感的MDCK細(xì)胞系或雞胚上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使其HA滴度8后，再進(jìn)行HI測(cè)

24、定l若傳12代后，HA滴度仍8者，可應(yīng)用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn) HA試驗(yàn)完成后，用國(guó)家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4種標(biāo)準(zhǔn)參照血清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)，確定病毒的型別和亞型，進(jìn)行HI試驗(yàn)時(shí)，需同時(shí)進(jìn)行4種標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)照。紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)步驟 4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè) 稀釋血清 加入25ul 4個(gè)血凝單位抗原，室溫孵育15-30分鐘 每孔加入50ul紅細(xì)胞懸液，充分搖勻。室溫孵育30-60分鐘 觀察記錄結(jié)果4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè) 4個(gè)凝集單位的配制 讀取紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的結(jié)果 計(jì)算

25、所須的4個(gè)凝集單位的病毒用量 用50ul檢測(cè)4個(gè)凝集單位時(shí)，用凝集效價(jià)除以8，所得商即為4個(gè)單位的稀釋度 用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)“回滴”，復(fù)核4個(gè)凝集單位 用50ul，前4孔完全凝集 。此時(shí)的抗原即為4個(gè)凝集單位紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)稀釋血清紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)稀釋血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul流感病毒的型別判定 標(biāo)準(zhǔn)參照血清對(duì)待鑒定病毒的抑制效價(jià)20才可以算為陽(yáng)性 一個(gè)待鑒定病毒不能同時(shí)被兩種或兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制 待鑒定病

26、毒與標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制，但與一種標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價(jià)大于其他參照血清4倍以上時(shí)，可以判定為此型別的流感病毒紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)-質(zhì)量控制 使用的試劑可靠無(wú)誤 處理后的血清有無(wú)殘余非特異性凝集素 讀取HA試驗(yàn)的結(jié)果是否正確 4個(gè)血凝單位是否準(zhǔn)確 紅細(xì)胞陰性對(duì)照 待鑒定病毒確保沒(méi)有被細(xì)菌污染 稀釋血清、病毒、紅細(xì)胞懸液加入量準(zhǔn)確一代測(cè)序原理：Sanger 測(cè)序雙脫氧末端終止法1977年，英國(guó)人Fred Sanger 發(fā)現(xiàn)，如果在DNA復(fù)制過(guò)程中摻入ddNTP，就會(huì)產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過(guò)電泳按長(zhǎng)度分辨。不同末端終止DNA鏈的長(zhǎng)度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置的ddNTP決定的。198

27、0年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)帶負(fù)電的分子向正極泳動(dòng)，片段的遷移率取決于分子量：小分子量的片段比大分子量的片段泳動(dòng)得快。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONCHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION技術(shù)的進(jìn)步 以Sanger法（雙脫氧核苷酸末端終止法）為代表的第一代測(cè)序技術(shù)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類(lèi)基因組圖譜等大量測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因組時(shí)代最理想的測(cè)序方法。 進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche 454、Illumina Solexa和ABISOL

28、iD為代表的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了，并迅速掀起了你追我趕的技術(shù)比拼高潮。測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步。測(cè)序通量不斷提升，測(cè)序成本不斷降低，現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入了一千美元測(cè)一個(gè)人全基因組的時(shí)代。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION下一代測(cè)序技術(shù) 下一代測(cè)序技術(shù)（next-generationsequencing）是對(duì)傳統(tǒng)Sanger法測(cè)序的一次革命性的改變，是一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的高通量的測(cè)序技術(shù)，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(deepsequencing)。為什么要使

29、用二代測(cè)序技術(shù) 一代測(cè)序?qū)σ阎≡w進(jìn)行測(cè)序（需要特異性擴(kuò)增） 對(duì)基因組較大的物種進(jìn)行測(cè)序 可得到更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)覆蓋度更高） 可對(duì)原始標(biāo)本和病毒含量低的樣品進(jìn)行測(cè)序 對(duì)變異頻繁的病原體進(jìn)行測(cè)序 檢測(cè)低頻突變 排除其他病原體感染 混合樣本測(cè)序以前完成一個(gè)人類(lèi)基因組的測(cè)序需要 3 年 時(shí)間,而使用二代測(cè)序技術(shù)則僅僅需要 1 周為什么流感病毒適用于NGSH3N2, H13N9H3N8,H7NH3N2 ,H4N57H1-H16, N1-N9H3N8H1N1,H2N2,H3N2,H5N1, H7N7,H9N2,H10N7H4, H5, H6,H7,H9, H10 ,H7N9N1,N2,N4,N7 H

30、5N1, H7N7, H9N2,H7N9CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONH4N6H1N1, H1N2,H2N3, H3N2,H4N6CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION利用CoverageAnalysis插件可以進(jìn)行禽流感分型Subtype: H9N2Subtype: H7N9CHIESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONH7N9和H9N2混合感染（培養(yǎng)樣品）H7N9和H9N2混合感染（環(huán)境樣品）環(huán)境樣品及其培養(yǎng)樣品的

31、比較：環(huán)境樣本也能很好地分型Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case ofavian infl uenza A H10N8 virus infection : a descriptive studyTimeline of the clinical course of the patient and identification of causative pathogenFrequency of glutamic acid was 87.6% versus 12.4% for lysine in the sample

32、 obtainedon day 7, and frequency was 3.3% versus 96.7% on day 9.深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)PB2的第627位的雜合突變Glu/Lys,其與病毒感染哺乳動(dòng)物相關(guān)；在治療過(guò)程中，Lys的突變比例增高對(duì)應(yīng)其逐漸增強(qiáng)的毒力CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION(Virus) Evolution進(jìn)化生物學(xué)是研究生命的起源及進(jìn)化的過(guò)程、原因、機(jī)制、速率和方向的科學(xué)起源（Origin）：從哪里來(lái)？進(jìn)程（Process/Route）：怎么來(lái)的？原因（Causes）：為什么會(huì)來(lái)？機(jī)制（Selection）：誰(shuí)驅(qū)動(dòng)它？速率（Dynamics）：快？慢