流感禽流感實驗室診療與新技術(shù)應(yīng)用新進展

1、流感禽流感實驗室診療與新技術(shù)應(yīng)用新進展流感病毒病原學(xué)2 流感病毒：正粘病毒科，流感病毒屬。 結(jié)構(gòu)分3部分：包膜、衣殼和核心。 78個基因組片段：PB2，PB1，PA， HA（血凝素）， NP，NA（神經(jīng)氨酸酶），MP，NS。 據(jù)NP和MP分型： A型甲型流感病毒 B型乙型流感病毒 C型丙型流感病毒流感病毒病原學(xué)3 （1）血凝素(Hemagglutinin HA) ：（柱形） 凝集紅細(xì)胞血凝現(xiàn)象，用于鑒定病毒 吸附宿主細(xì)胞與受體結(jié)合（侵入細(xì)胞的關(guān)鍵） 抗原性相應(yīng)抗體，有中和作用 易變異（分亞型） （2）神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase NA）：（蘑菇形） 參與病毒釋放，促進病毒擴散 抗原性

2、 易變異（分亞型） （3）病毒變異：抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變親脂類病毒或中等大小的病毒親脂類病毒或中等大小的病毒（如：（如：HSV,CMV,RSV,HIV,HBV）細(xì)菌繁殖體（如：金葡，綠膿）細(xì)菌繁殖體（如：金葡，綠膿）真菌（如，念珠菌屬，曲霉屬）真菌（如，念珠菌屬，曲霉屬）非脂類或小病毒（如脊非脂類或小病毒（如脊髓灰質(zhì)炎病毒髓灰質(zhì)炎病毒 ,柯薩奇病毒）柯薩奇病毒）分枝桿菌（如分枝桿菌（如TB，M.terrae ）Cryptosporidium parvum 隱孢子蟲隱孢子蟲 細(xì)菌芽孢細(xì)菌芽孢Prions敏感敏感耐受耐受低效中效 高 效滅菌滅菌（高，延時）（高，延時）消毒劑水平消毒劑水平氣體滅菌氣體

3、滅菌蒸汽滅菌蒸汽滅菌 理化特性：病毒理化特性：病毒對乙醇、碘伏、對乙醇、碘伏、碘酊敏感；對熱碘酊敏感；對熱敏感，敏感，56305630分分鐘可滅活。鐘可滅活。流感病毒病原學(xué)5 宿主范圍：人、豬、馬、禽類等 宿主界限不十分嚴(yán)格，在一定的條件下可突破種間屏障，在不同種間傳播 動物流感同人類流感關(guān)系密切。豬是儲存宿主，也可能是“混合器”流感病毒病原學(xué)6 培養(yǎng)特點 細(xì)胞、動物 致病性和免疫性病毒侵入人體后在呼吸道黏膜和肺部繁殖，病毒和其代謝產(chǎn)物進入血液引起相應(yīng)的臨床癥狀。 引起體液和細(xì)胞免疫流感監(jiān)測目的 （一）監(jiān)測流感活動水平和流行動態(tài)； （二）及時發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并作出預(yù)警； （三）為全球及我國流感

4、疫苗毒株的預(yù)測和推薦提供依據(jù)。流感監(jiān)測內(nèi)容 （一）流感樣病例監(jiān)測 （二）流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測流感樣病例監(jiān)測標(biāo)本采集 采集對象： 流感樣病例流感樣病例 發(fā)熱（體溫發(fā)熱（體溫3838），伴咳嗽或咽痛之一者），伴咳嗽或咽痛之一者 采集時間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集，最好是24h內(nèi) 采集地點：國家級流感樣病例監(jiān)測哨點醫(yī)院 采集數(shù)量：根據(jù)就診ILI病例數(shù)的多少，每家哨點醫(yī)院每周至少采集20份流感樣病例的標(biāo)本(根據(jù)流行季節(jié)、流行強度、防控工作需要實時調(diào)整）暴發(fā)疫情標(biāo)本采集 （1）1周內(nèi)，在同一學(xué)校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；

5、或發(fā)生2例及以上有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的死亡病例； （2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一鄉(xiāng)或街道）1周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例異常增多。 每一起暴發(fā)疫情一般應(yīng)當(dāng)采集10份咽、鼻拭子標(biāo)本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應(yīng)當(dāng)全部采樣）。采集標(biāo)本類型 常規(guī)常規(guī)特殊特殊咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液、含漱液 血清 呼吸道灌洗液 肺組織活檢標(biāo)本 尸檢標(biāo)本采樣液 常用的采樣液有：的Hanks液或MEM； 標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４?，同時加入抗菌素（入慶大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ）咽拭子采集咽拭子咽拭子 用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后

6、壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。 注意：采樣前1h內(nèi)不要進食和飲水，采樣液中嚴(yán)禁加入抗生素標(biāo)本的保存與運送 標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下，盡快（哨點監(jiān)測48小時疫情24小時內(nèi)）運送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室 未能送至實驗室的，應(yīng)置-70或以下保存，一周內(nèi)送實驗室 凍存的標(biāo)本，盡量避免其反復(fù)凍融，在冷藏條件下送到實驗室實驗室生物安全要求l季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級實驗室進行。l流感病毒分離鑒定及其它檢測過程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過程必須在生物安全級實驗室的生物安全柜里操作。l用滅活的抗原進行血清學(xué)檢測時可以在生物安全級實驗室進行標(biāo)本的接收 接收標(biāo)本時必須核對送檢

7、表 流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室的工作人員接到標(biāo)本后，24小時內(nèi)將“流感/人禽流感監(jiān)測病例標(biāo)本原始登記送檢表”（表2）錄入到“監(jiān)測信息系統(tǒng)”標(biāo)本的處理 標(biāo)本送至實驗室后，立即進行處理，未加抗菌素的加入適量的抗菌素。 將原始標(biāo)本一分為三份，一份（1ml）用于MDCK細(xì)胞接種，一份（1ml）用于雞胚接種，一份（1ml）保存待復(fù)核。（根據(jù)檢測程序?qū)崟r調(diào)整）實驗室檢測分子診斷RT-PCR、real-time RT-PCR主要選用的基因片段：M基因-檢測A型流感，NS基因-檢測B型流感， HA基因-檢測禽流感、季節(jié)流感H1/H3以及其他亞型病毒分離和血凝抑制試驗可用MDCK細(xì)胞和SPF雞胚分離流感病毒，對于高致病

8、性禽流感病毒分離要求BSL-3實驗室；可以診斷感染，但無法為臨床診斷及時提供結(jié)果。快速試紙條法一些商用快速檢測可以區(qū)分A和B型流感病毒，但是檢測季節(jié)性流感病毒的靈敏度不佳。因此，快速檢測陰性結(jié)果可能是假陰性，不能作為禽流感感染的最后診斷。 免疫熒光法免疫熒光試驗可以區(qū)分A和B型流感病毒 。免疫熒光試驗的結(jié)果取決于臨床標(biāo)本的質(zhì)量，操作技能。因此，免疫熒光試驗陰性結(jié)果可能是假陰性，不能作為禽流感感染的最后診斷。 血清學(xué)季節(jié)性流感檢測流程臨床標(biāo)本采集接種MDCK細(xì)胞接種雞胚紅細(xì)胞凝集抑制試驗，鑒定病毒紅細(xì)胞凝集試驗流感病毒核酸檢測陽性PCR鑒定人感染高致病性禽流感標(biāo)本實驗室檢測流程圖呼吸道、尸檢標(biāo)本

9、、其它標(biāo)本病毒分離和鑒定標(biāo)本采集對象血清標(biāo)本HI試驗、微量中和試驗、單擴溶血報告采集檢測第三份血清雙份血抗體滴度4倍增長核酸檢測：RT-PCR或Real-Time PCR，引物至少應(yīng)包括A、兩對H5再次采樣再次檢測按照人流感監(jiān)測方法分離鑒定可疑A及兩對H5陽性陽性兩對H5陰性陰性擴增產(chǎn)物序列測定 雙份血抗體滴度無4倍增長報告報告核酸檢測的原理 核酸提取的原理 PCR的原理 實時熒光定量PCR的原理核酸提取的原理 無論是從真核細(xì)胞或是從細(xì)菌病毒中提取核酸，涉及的基本原理是使細(xì)胞膜或細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，再用某些有機溶劑抽提使核酸分離或使核酸吸附于某些顆粒的表面，再進行沉淀或洗脫，

10、從而獲取核酸。核酸提取核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit1）在1.5ml 離心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 2）取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）140ul加入上述離心管中（糞便標(biāo)本用10懸液的上清），震蕩15s，室溫放置10min。 3）稍離心后，加入560ul無水乙醇，震蕩15s。4）將Viral RNA Mini spin柱子取出，將步驟3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm離心1min。棄離心液。5）重復(fù)步驟4。6）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm離心

11、1min。棄套管及其離心液。7）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm離心3min，棄套管及其離心液。8）將吸附柱放入一新的1.5ml 離心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室溫靜置13分鐘，8000rpm離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即實驗或20以下保存。PCR技術(shù)的原理 生物體的遺傳物質(zhì)：核酸（DNA/RNA） 堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。 人類體細(xì)胞中有31億個堿基對。 除了真正雙胞胎外, 每個人的DNA是獨一無二的, 就好像指紋一樣。PCR技術(shù)的原理PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分

12、別與模板互補的DNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。特異性：引物序列靈敏度：擴增100萬倍1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2535輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍RT-PCR和real-time PCR RT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，擴增的模板為RNA，增加RNADNA過程。 Real-time PCR：即實時熒光定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實實時監(jiān)測時監(jiān)測整個PCR進

13、程。RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）熒光定量PCR 第一次使用前引物稀釋 1引物工作濃度（40M） 配制方法：（1）將新合成的引物開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100M，可作為儲存液。（例如：假設(shè)合成引物每管2OD，若2OD的量為9.1 nmol ，加水量為109.191l）（3）將100M的引物2.5倍稀釋，此時濃度為40M，可作為工作濃度。 2探針工作濃度（10/20M/） 配制方法：（

14、1）將新合成的探針管開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100M，可作為儲存液。（3）將100M的探針10/5倍稀釋，此時濃度為10/20M，可作為工作濃度。熒光定量PCR 引物和探針 稀釋好的冰凍的引物和探針進行融化（已融的探針避光2-8可保存多達3個月，不要對探針反復(fù)凍融）； 渦旋振蕩引物和探針； 瞬時離心引物和探針，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的試劑 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在試驗

15、過程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 試劑：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen，貨號：11732-020或11745-100） 分子級無菌蒸餾水 (無RNA酶和DNA酶) 正反向引物 (40M) 雙重標(biāo)記探針(10M)反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45 反應(yīng)體系為25ul 注：*在55 度這一步驟中要收集熒光信號（FAM）熒光PCR結(jié)果陽性樣品熒光PCR結(jié)果陰性樣品熒光PCR結(jié)果可疑樣品病毒分離

16、-MDCK細(xì)胞3335培養(yǎng)接種流程清洗MDCK 細(xì)胞臨床采樣標(biāo)本接種細(xì)胞Hanks液清洗細(xì)胞，一般清洗2遍3335度吸附12小時Hanks液清洗細(xì)胞加入病毒生長液，3335度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞病變?yōu)?+或4+時，即75100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時進行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融12次，以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲 （細(xì)胞病變情況：細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時細(xì)胞部分或全部脫落 ）根據(jù)使用的細(xì)胞瓶的大小，決定接種量，一般的小細(xì)胞瓶接種0.5ml的臨床標(biāo)本流程圖MDCK細(xì)胞病毒分離lCPE出現(xiàn)時間與感染病毒的型別、

17、毒株的差異、感染量的大小和MDCK細(xì)胞的敏感性有關(guān)l每日觀察細(xì)胞病變(CPE)l標(biāo)本接種后7天還未出現(xiàn)CPE，維持液經(jīng)HA試驗陰性者，繼續(xù)盲傳12代后，HA試驗仍為陰性者，則MDCK細(xì)胞病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去 細(xì)胞病變圖雞胚病毒分離檢卵標(biāo)本準(zhǔn)備雞胚分離方法-試劑準(zhǔn)備1) 91) 91111日齡雞胚日齡雞胚2) 2) 照蛋燈照蛋燈3) 70%3) 70%7575酒精酒精4) 1ml 4) 1ml 一次性注射器一次性注射器5) 5) 雞蛋開孔器雞蛋開孔器6) 6) 無菌膠布或蠟無菌膠布或蠟7) 10ml 7) 10ml 試管和試管架試管和試管架8) 10ml 8) 10ml 移液管或移液管或1

18、ml1ml移液器及無菌吸尖移液器及無菌吸尖9) 9) 無菌鑷子無菌鑷子10) 10) 無菌眼科剪無菌眼科剪雞胚分離方法-標(biāo)記雞胚 檢視標(biāo)記雞胚 用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài) 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊 胎動：活胚有明顯的自然運動，死胚無胎動 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊 膜與雞胚胎的另一面形成明顯的界限 標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊的界限、胚胎頭部的位置 如果雞胚是死胚、沒有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉 接種病毒方法接種病毒方法 單腔接種 盲種雙腔接種 燈下接種 開窗接種雞胚分離方法雞胚分離方法雞胚分離流程（1） 將標(biāo)記好的雞胚的氣室朝上放置在蛋

19、盤上，通常每個樣本接種3個雞胚 用70%75酒精消毒雞胚，在氣室端鉆孔，開10 x6mm窗口 用注射器吸200l處理過的臨床標(biāo)本，裝上16 號針頭 從窗口中滴入無菌的液體石蠟，然后輕輕晃動雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開，此時在照蛋燈下即 可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的 鄂下胸前，用針頭輕輕撥動下顎及腿，當(dāng)進入羊膜腔時，能看到雞胚隨著針頭的撥動而動，即可注射100l標(biāo)本。將針頭退出至 寸，將另外100 l標(biāo)本 注入雞胚尿囊腔雞胚分離流程（2）用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外的兩枚雞胚將針頭棄于合適的生物安全裝置中用消毒過的醫(yī)用膠布封口 3335oC 溫箱培養(yǎng)雞胚23

20、 天。臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天 雞胚進行病毒分離培養(yǎng)時，每天檢查雞胚生長情況，24小時內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去雞胚分離流程（3）收獲尿囊液和羊水收獲尿囊液和羊水雞胚在收獲前應(yīng)4過夜或至少放置4小時標(biāo)記15ml 無菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號一致用70%75酒精消毒雞胚頂部用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時也可以將3個雞胚的羊水合并雞胚病毒鑒定 經(jīng)HA試驗陰性者，將羊水和尿囊液混合，繼續(xù)盲傳1代（72小時），如仍為陰性，則雞胚病毒分離為陰性，標(biāo)本可

21、棄去雞胚收獲HA試驗病毒鑒定 紅細(xì)胞凝集 紅細(xì)胞凝集抑制試驗病毒鑒定流程紅細(xì)胞凝集試驗4個凝集單位配制“回滴”紅細(xì)胞凝集抑制試驗判定流感病毒型別紅細(xì)胞凝集試驗（HA）lMDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進行紅細(xì)胞凝集試驗（HA），確定病毒滴度l 原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能結(jié)合并）含有能結(jié)合并識別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺識別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病乳動物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識別，產(chǎn)生凝

22、集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性毒能與其結(jié)合并識別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)紅細(xì)胞紅細(xì)胞雞雞火雞火雞豚鼠豚鼠人人 O 型 血 紅型 血 紅細(xì)胞細(xì)胞馬馬適用范圍流感和禽流感病毒流 感 和 禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒終濃度（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形狀U或V型U或V型U型U型U型孵育時間30min30min45min45min60min細(xì)胞對照細(xì)胞沉積成圓點狀，傾斜時細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì) 胞 沉 積成 圓

23、點 狀， 傾 斜 時細(xì) 胞 向 下流 成 淚 滴狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀A(yù)HBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀釋完病毒液后加入稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液50ulPBS稀釋病毒加入配制好的紅細(xì)胞懸液充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果病毒病毒原液原液1：21：128HA： 32HA128 HA： 4紅細(xì)胞凝集試驗（HA）lHA滴度8，進行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗；HA滴度8者，繼續(xù)在敏感的MDCK細(xì)胞系或雞胚上進行傳代培養(yǎng)，使其HA滴度8后，再進行HI測

24、定l若傳12代后，HA滴度仍8者，可應(yīng)用核酸檢測方法進行鑒定紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗 HA試驗完成后，用國家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4種標(biāo)準(zhǔn)參照血清，進行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗，確定病毒的型別和亞型，進行HI試驗時，需同時進行4種標(biāo)準(zhǔn)抗原對照。紅細(xì)胞凝集抑制試驗步驟 4個凝集單位的配制和檢測 稀釋血清 加入25ul 4個血凝單位抗原，室溫孵育15-30分鐘 每孔加入50ul紅細(xì)胞懸液，充分搖勻。室溫孵育30-60分鐘 觀察記錄結(jié)果4個凝集單位的配制和檢測 4個凝集單位的配制 讀取紅細(xì)胞凝集試驗的結(jié)果 計算

25、所須的4個凝集單位的病毒用量 用50ul檢測4個凝集單位時，用凝集效價除以8，所得商即為4個單位的稀釋度 用紅細(xì)胞凝集試驗“回滴”，復(fù)核4個凝集單位 用50ul，前4孔完全凝集 。此時的抗原即為4個凝集單位紅細(xì)胞凝集抑制試驗稀釋血清紅細(xì)胞凝集抑制試驗稀釋血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul流感病毒的型別判定 標(biāo)準(zhǔn)參照血清對待鑒定病毒的抑制效價20才可以算為陽性 一個待鑒定病毒不能同時被兩種或兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制 待鑒定病

26、毒與標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制，但與一種標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價大于其他參照血清4倍以上時，可以判定為此型別的流感病毒紅細(xì)胞凝集抑制試驗-質(zhì)量控制 使用的試劑可靠無誤 處理后的血清有無殘余非特異性凝集素 讀取HA試驗的結(jié)果是否正確 4個血凝單位是否準(zhǔn)確 紅細(xì)胞陰性對照 待鑒定病毒確保沒有被細(xì)菌污染 稀釋血清、病毒、紅細(xì)胞懸液加入量準(zhǔn)確一代測序原理：Sanger 測序雙脫氧末端終止法1977年，英國人Fred Sanger 發(fā)現(xiàn)，如果在DNA復(fù)制過程中摻入ddNTP，就會產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長度分辨。不同末端終止DNA鏈的長度是由摻入到新合成鏈上隨機位置的ddNTP決定的。198

27、0年諾貝爾化學(xué)獎帶負(fù)電的分子向正極泳動，片段的遷移率取決于分子量：小分子量的片段比大分子量的片段泳動得快。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONCHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION技術(shù)的進步 以Sanger法（雙脫氧核苷酸末端終止法）為代表的第一代測序技術(shù)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組圖譜等大量測序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因組時代最理想的測序方法。 進入21世紀(jì)后，以Roche 454、Illumina Solexa和ABISOL

28、iD為代表的第二代測序技術(shù)誕生了，并迅速掀起了你追我趕的技術(shù)比拼高潮。測序技術(shù)的進步。測序通量不斷提升，測序成本不斷降低，現(xiàn)在已經(jīng)進入了一千美元測一個人全基因組的時代。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION下一代測序技術(shù) 下一代測序技術(shù)（next-generationsequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的高通量的測序技術(shù)，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。為什么要使

29、用二代測序技術(shù) 一代測序?qū)σ阎≡w進行測序（需要特異性擴增） 對基因組較大的物種進行測序 可得到更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)覆蓋度更高） 可對原始標(biāo)本和病毒含量低的樣品進行測序 對變異頻繁的病原體進行測序 檢測低頻突變 排除其他病原體感染 混合樣本測序以前完成一個人類基因組的測序需要 3 年 時間,而使用二代測序技術(shù)則僅僅需要 1 周為什么流感病毒適用于NGSH3N2, H13N9H3N8,H7NH3N2 ,H4N57H1-H16, N1-N9H3N8H1N1,H2N2,H3N2,H5N1, H7N7,H9N2,H10N7H4, H5, H6,H7,H9, H10 ,H7N9N1,N2,N4,N7 H

30、5N1, H7N7, H9N2,H7N9CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONH4N6H1N1, H1N2,H2N3, H3N2,H4N6CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION利用CoverageAnalysis插件可以進行禽流感分型Subtype: H9N2Subtype: H7N9CHIESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONH7N9和H9N2混合感染（培養(yǎng)樣品）H7N9和H9N2混合感染（環(huán)境樣品）環(huán)境樣品及其培養(yǎng)樣品的

31、比較：環(huán)境樣本也能很好地分型Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case ofavian infl uenza A H10N8 virus infection : a descriptive studyTimeline of the clinical course of the patient and identification of causative pathogenFrequency of glutamic acid was 87.6% versus 12.4% for lysine in the sample

32、 obtainedon day 7, and frequency was 3.3% versus 96.7% on day 9.深度測序發(fā)現(xiàn)PB2的第627位的雜合突變Glu/Lys,其與病毒感染哺乳動物相關(guān)；在治療過程中，Lys的突變比例增高對應(yīng)其逐漸增強的毒力CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION(Virus) Evolution進化生物學(xué)是研究生命的起源及進化的過程、原因、機制、速率和方向的科學(xué)起源（Origin）：從哪里來？進程（Process/Route）：怎么來的？原因（Causes）：為什么會來？機制（Selection）：誰驅(qū)動它？速率（Dynamics）：快？慢