第7章+蛋白質(zhì)分離純化與表征

1、蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異 分子的大小和形狀 酸堿性質(zhì) 溶解度 吸附性質(zhì) 對配體分子的特異生物學(xué)親和力蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，制訂分離純化的合理程序。制訂分離純化的合理程序。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含有酸含有酸/ /堿堿AAAA殘基殘基具有兩性具有兩性 堿堿/ /酸酸越大越大pI pI 越大越大 pI通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量 一般在一萬至一百萬道爾頓之間一般在一萬至一百萬道爾頓之間 1道爾頓道爾頓1C12絕對質(zhì)量絕對質(zhì)量/12 1.6610

2、-27千克千克二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的原理和方法（一） 根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量（二） 滲透壓法測定相對分子質(zhì)量（三） 蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)（四） 沉降分析法測定相對分子質(zhì)量（五） 凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量（六） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最小分子量（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最小分子量1 1、測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量、測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2 2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對分子質(zhì)量最低相對分子質(zhì)量= 100* 55.8/鐵的百分含量鐵的百分含量例如肌紅蛋白含鐵量為例如肌紅蛋

3、白含鐵量為0.335%，那么其最低相對，那么其最低相對分子質(zhì)量就是分子質(zhì)量就是55.8/0.335 100 = 16700（五）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量（五）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子通過凝膠柱的速度并不取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯托克半價(jià)。如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體過柱速度相同，則認(rèn)為具有與該球體相同的半徑，稱斯托克半徑蛋白質(zhì)混合樣蛋白質(zhì)混合樣w 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測和斯托克半徑）和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球形）蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球形）（六）（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法 測定相對分子

4、質(zhì)量測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于：它的遷移率取決于：w所帶電荷所帶電荷w分子量分子量w分子形狀分子形狀但是如果在該系統(tǒng)中添加SDS和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量。十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵蛋白質(zhì)分子的形狀蛋白質(zhì)分子的形狀蛋白質(zhì)分子在溶液中的形狀或構(gòu)象的信息，可借助其摩擦系數(shù)與理想球體

5、的摩擦系數(shù)之比，也就是所謂的蛋白質(zhì)分子的摩擦比來推測。摩擦比越大，蛋白質(zhì)分子的不對稱性越高。三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）（一）膠體性質(zhì)膠體性質(zhì)（colloidal system）膠體溶液的特點(diǎn)：膠體溶液的特點(diǎn)：w分子直徑在分子直徑在1-100 nm1-100 nm內(nèi)內(nèi)w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.2.水膜彈性水膜彈性3.3.質(zhì)點(diǎn)的大?。ㄙ|(zhì)點(diǎn)的大?。? 1100nm100nm）w蛋

6、白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的（二）蛋白質(zhì)的沉淀沉淀 Pr從膠體溶液中析出從膠體溶液中析出任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)沉淀I I 可逆沉淀可逆沉淀 溫和溫和條件，改變?nèi)芤簵l件，改變?nèi)芤簆H或或Pr所所帶電荷帶電荷 Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化 適當(dāng)條件下可適當(dāng)條件下可重新溶解重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀 pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等 不可逆沉淀不可逆沉淀 強(qiáng)烈強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件沉淀?xiàng)l件 破壞

7、破壞Pr膠體溶液膠體溶液穩(wěn)定性穩(wěn)定性 也破壞也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 沉淀沉淀不能再重新溶解不能再重新溶解變性沉淀變性沉淀 如加熱沉淀、強(qiáng)酸如加熱沉淀、強(qiáng)酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀等和生物堿沉淀等1.1.鹽析法鹽析法加入大量中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉加入大量中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉）脫去蛋白質(zhì)的水化層，和氯化鈉）脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性鹽析一般不引起變性 等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解鹽溶鹽溶 原因？原因？鹽溶鹽溶鹽析鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀

8、，加入少加入少量鹽離子量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中溶于水中鹽溶鹽析 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會沉淀析出會沉淀析出 原因？原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（NH4）2SO4）2.2.有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.3.等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)分子帶有相同數(shù)量的正負(fù)電荷，蛋白質(zhì)分子帶有相同數(shù)量的正負(fù)電荷，因此，蛋白質(zhì)分子相互吸引，從而聚集因此，蛋白質(zhì)分子相互吸引，從而聚集沉淀。沉淀。4.4.重金

9、屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀 與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.5.生物堿試劑和某些酸類沉淀生物堿試劑和某些酸類沉淀 與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.6.加熱變性沉淀加熱變性沉淀 天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.1.前處理：因動(dòng)前處理：因動(dòng)/ /植物植物/ /細(xì)菌而異細(xì)菌而異2.2.粗分級分離：采用鹽析粗分級分離：采用鹽析/ /等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀/ /有機(jī)溶劑分級分離等方法有機(jī)溶劑分級分離等方法3.3.

10、細(xì)分級分離：采用凝膠過濾、離子交細(xì)分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等換層析、吸附層析以及親和層析等4.4.結(jié)晶是最后步驟結(jié)晶是最后步驟五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)根據(jù)分子大小不同分子大小不同的純化方法的純化方法 1、透析和超過濾、透析和超過濾w利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其 與小分子物質(zhì)分開與小分子物質(zhì)分開w半透膜為玻璃紙或纖維素材料半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析血液透析小分子溶出小分子被帶出小分子被帶出透析機(jī)透析機(jī)透析液透析液加加壓壓血液血液2 2、密度梯度（區(qū)帶）離心、密度梯度（區(qū)帶）離心用一定的介質(zhì)（如蔗糖）在離心管內(nèi)

11、形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將蛋白質(zhì)混合液置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使蛋白質(zhì)分層、分離。 3、凝膠過濾、凝膠過濾3. 凝膠過濾（二）利用溶解度差別的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法 1. 1.等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 調(diào)整溶液調(diào)整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI處依次沉淀處依次沉淀 2.2.鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析3.3.有機(jī)溶劑分級分離法有機(jī)溶劑分級分離法w降低介電常數(shù)降低介電常數(shù)w爭奪水化膜爭奪水化膜影響溶解度的外部因素有：pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。4. 溫度對蛋白質(zhì)溶劑度的影響溫度對蛋白質(zhì)溶劑度的影響（三（三) )根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離

12、方法1.1.電泳電泳原理：原理： 蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0 0 分子大小不同，電場中移動(dòng)速度也不同分子大小不同，電場中移動(dòng)速度也不同平板電泳平板電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳雙向電泳雙向電泳離子交換層析離子交換層析（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì) 羥磷石灰層析羥磷石灰層析 疏水作用層析疏水作用層析（五）利用對配體的特異生物學(xué)（五）利用對配體的特異生物學(xué) 親和力的純化方法親和力的純化方法親和色譜顆粒親和色譜顆粒具有極強(qiáng)的專一性具有極強(qiáng)的專一性（六）高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析（六）高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析多種類型

13、的柱層析都可用多種類型的柱層析都可用HPLCHPLC來代替，例如分配來代替，例如分配層析，離子交換層析，吸附層析以及凝膠過濾。層析，離子交換層析，吸附層析以及凝膠過濾。六、蛋白質(zhì)含量測定和純度鑒定（一）蛋白質(zhì)含量測定常用方法：凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法、染料結(jié)合法（bradford或考馬斯亮藍(lán)法）和膠體金測定法。Lowry法，主要是利用folin-酚試劑能與Cu+離子反應(yīng)，而Cu+是由蛋白質(zhì)的巰基或酚基氧化Cu2+而產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)：含兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵化合物與CuSO4溶液都能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)省市紫紅色或藍(lán)紫色復(fù)合物。（二）蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用電泳

14、、沉降、HPLC和溶解度分析。凝膠過濾和SDS-PAGE 均是利用凝膠，按照分子大小分離蛋白質(zhì)的，為什么凝膠過濾時(shí)，蛋白質(zhì)分子越小，洗脫速度越慢，而在SDS-PAGE中，蛋白質(zhì)分子越小，遷移速度越快 凝膠過濾時(shí)，凝膠顆粒排阻Mr較大的蛋白質(zhì)，僅允許Mr較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入顆粒內(nèi)部，所以Mr較大的蛋白質(zhì)只能在凝膠顆粒之間的空隙中通過，可以用較小體積的洗脫液從層析柱中洗脫出來。而Mr小的蛋白質(zhì)必須用較大體積的洗脫液才能從層析柱中洗脫出來。SDS- PAGE分離蛋白質(zhì)時(shí)，所有的蛋白質(zhì)均要從凝膠的網(wǎng)孔中穿過，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量越小，受到的阻力也越小，移動(dòng)速度就越快。 一種蛋白質(zhì)的混合物在pH6的DEAE-纖維素柱中被分離，用pH6稀鹽緩沖液可以洗脫C，用pH6的高鹽緩沖液，B和A依次被洗脫，用凝膠過濾測定得A的Mr 是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS-PAGE只發(fā)現(xiàn)