RT qPCR(實時熒光定量PCR)課件

實時熒光定量PCR技術(shù)

RealTimeQuantitativePCR南開大學醫(yī)學院lfnn實時熒光定量PCR技術(shù)

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RT-qPCR原理Contents1

RT-qPCR步驟2

SYBR實驗步驟3LogoRT-qPCR原理Contents1RT-qPLogoRT-qPCR原理1定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最后通過通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析的方法。1.熒光原理：SYBRGreen2.定量原理：（1）介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值（2）定量原理：

絕對定量（標準曲線）、相對定量（2-ΔΔCt）

（3）融解曲線LogoRT-qPCR原理1定義：在PCR反應體系中加入熒非特異性熒光標記：

1、SYBRGreen

結(jié)合于雙鏈DNA小溝之間，只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。（在變性過程中無熒光，在復性及延伸過程中發(fā)出熒光）RT-qPCR原理---熒光原理非特異性熒光標記：RT-qPCR原理---熒光原理特異性熒光標記：

1、TaqMan

水解型雜交探針。5′端標記有報告基團R，3′端標記有熒光淬滅基團Q。探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針R與Q分開，發(fā)出熒光。

2、MolecularBeacon

分子信標。標記熒光的發(fā)夾探針，環(huán)與目標序列互補，莖由互補配對序列組成。變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光；延伸過程：不產(chǎn)生熒光；退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號。

3、Amplisensor

雙鏈信號引物，進行半巢式擴增；隨著PCR循環(huán)的重復進行，信號引物的雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，其中一條鏈參與到產(chǎn)物的合成中，熒光消失，產(chǎn)物量與熒光成反比。QQR特異性熒光標記：QQRLogoRT-qPCR原理----定量原理1擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集Ct值的定義：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值極具重現(xiàn)性。分析定量時多取15-35較好。熒光信號閾值（threshold）：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值。熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1擴增曲線圖：CLogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反應：

X=X0*2n非理想的PCR反應：

X=X0(1+Ex)nn：

擴增反應的循環(huán)次數(shù)X：

第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率

logX0=-log(1+Ex)*Ct+log

X

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量.1.絕對定量LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反LogoRT-qPCR原理----絕對定量1模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量1.絕對定量LogoRT-qPCR原理----絕對定量1模板DNALogoRT-qPCR原理----絕對定量1R2為相關(guān)系數(shù)：R2>0.99時，認為兩數(shù)值之間相關(guān)性好。E為擴增效率：一般認為在90%-110%之間數(shù)據(jù)可用。LogoRT-qPCR原理----絕對定量1R2為相關(guān)系數(shù)LogoRT-qPCR原理----相對定量12.相對定量病人內(nèi)參基因病人目的基因?qū)φ諆?nèi)參基因?qū)φ漳康幕駽tabcd結(jié)果表示病人的目的基因的表達是對照組目的基因表達的多少倍。LogoRT-qPCR原理----相對定量12.相對定量病RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)融解曲線為單一峰，無非特異性熒光，定量準確。溶解峰反映反應中擴增到的產(chǎn)物的量。前面雜峰較多時可能原因為樣品未混勻。RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強度TmTm值：RT-qPCR步驟----SYBRGreen法1.準備物品：檢測樣本、內(nèi)參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、Realplex軟件2.將樣本等稍許離心3.加樣（可將所有共同物質(zhì)加入同一管中，混勻后分散入其他管中）

反應體系：ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL樣本1μL4.將八連管標記后離心至無壁掛液體5.將其置入Realplex儀中，

設(shè)置程序：95℃15s95℃15s57℃30s74℃30s45循環(huán)，END后右鍵設(shè)置“insert---meltingcurve”，后綠色運行6、反應結(jié)束后將數(shù)據(jù)導出，分析數(shù)據(jù)。RT-qPCR步驟----SYBRGreen法1.準備物反應體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2（多聚酶的激活劑）濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應Buffer體系的優(yōu)化反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同RT-qPCR步驟----SYBRGreen法反應體系的建立及優(yōu)化:RT-qPCR步驟----SYBR對DNA模板沒有選擇性----適用于任何DNA使用方便-----不必設(shè)計復雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性，但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件對引物特異性要求較高缺點對DNA模板沒有選擇性優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)ThankyouThankyou實時熒光定量PCR技術(shù)

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RT-qPCR原理Contents1

RT-qPCR步驟2

SYBR實驗步驟3LogoRT-qPCR原理Contents1RT-qPLogoRT-qPCR原理1定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最后通過通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析的方法。1.熒光原理：SYBRGreen2.定量原理：（1）介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值（2）定量原理：

絕對定量（標準曲線）、相對定量（2-ΔΔCt）

（3）融解曲線LogoRT-qPCR原理1定義：在PCR反應體系中加入熒非特異性熒光標記：

1、SYBRGreen

結(jié)合于雙鏈DNA小溝之間，只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。（在變性過程中無熒光，在復性及延伸過程中發(fā)出熒光）RT-qPCR原理---熒光原理非特異性熒光標記：RT-qPCR原理---熒光原理特異性熒光標記：

1、TaqMan

水解型雜交探針。5′端標記有報告基團R，3′端標記有熒光淬滅基團Q。探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針R與Q分開，發(fā)出熒光。

2、MolecularBeacon

分子信標。標記熒光的發(fā)夾探針，環(huán)與目標序列互補，莖由互補配對序列組成。變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光；延伸過程：不產(chǎn)生熒光；退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號。

3、Amplisensor

雙鏈信號引物，進行半巢式擴增；隨著PCR循環(huán)的重復進行，信號引物的雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，其中一條鏈參與到產(chǎn)物的合成中，熒光消失，產(chǎn)物量與熒光成反比。QQR特異性熒光標記：QQRLogoRT-qPCR原理----定量原理1擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集Ct值的定義：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值極具重現(xiàn)性。分析定量時多取15-35較好。熒光信號閾值（threshold）：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值。熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1擴增曲線圖：CLogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反應：

X=X0*2n非理想的PCR反應：

X=X0(1+Ex)nn：

擴增反應的循環(huán)次數(shù)X：

第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率

logX0=-log(1+Ex)*Ct+log

X

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量.1.絕對定量LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反LogoRT-qPCR原理----絕對定量1模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量1.絕對定量LogoRT-qPCR原理----絕對定量1模板DNALogoRT-qPCR原理----絕對定量1R2為相關(guān)系數(shù)：R2>0.99時，認為兩數(shù)值之間相關(guān)性好。E為擴增效率：一般認為在90%-110%之間數(shù)據(jù)可用。LogoRT-qPCR原理----絕對定量1R2為相關(guān)系數(shù)LogoRT-qPCR原理----相對定量12.相對定量病人內(nèi)參基因病人目的基因?qū)φ諆?nèi)參基因?qū)φ漳康幕駽tabcd結(jié)果表示病人的目的基因的表達是對照組目的基因表達的多少倍。LogoRT-qPCR原理----相對定量12.相對定量病RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)融解曲線為單一峰，無非特異性熒光，定量準確。溶解峰反映反應中擴增到的產(chǎn)物的量。前面雜峰較多時可能原因為樣品未混勻。RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強度TmTm值：RT-qPCR步驟----SYBRGreen法1.準備物品：檢測樣本、內(nèi)參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、Realplex軟件2.將樣本等稍許離心3.加樣（可將所有共同物質(zhì)加入同一管中，混勻后分散入其他管中）

反應體系：ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL樣本1μL4.將八連管標記后離心至無壁掛液體5.將其置入Realplex儀中，

設(shè)置程序：95℃1