第十五章酵母基因工程

1、第十五章 酵母基因工程第一節(jié)第一節(jié) 酵母基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展酵母基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢趨勢1974年，2m質(zhì)粒。1977年，酵母基因克隆的蓬勃開展1978年，酵母和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒1981年，釀酒酵母表達(dá)人干擾素基因1983年，酵母人工染色體(YAC載體) 1989年，酵母雙雜交系統(tǒng)1996年，釀酒酵母作為第一個(gè)真核生物完成了全基因組的測序一、酵母基因工程的優(yōu)點(diǎn)一、酵母基因工程的優(yōu)點(diǎn)1、真核生物，大多具有較高的安全性；2、繁殖速度快，能高密度培養(yǎng)；3、外源基因操作方便；4、高表達(dá)的啟動(dòng)子可誘導(dǎo)調(diào)控；5、翻譯后加工和分泌；6、不會(huì)形成不溶性的重組蛋白包含體，易于分離純化；7、去起始甲硫

2、氨酸，避免免疫反應(yīng)；8、已完成全基因組測序 二、酵母基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀二、酵母基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀1、改造酵母本身用以提高發(fā)酵性能；2、利用酵母作為宿主表達(dá)異源蛋白；3、通過一系列的基因敲除和基因?qū)敫淖兘湍傅拇x途徑，從而讓酵母產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。三、酵母基因工程的發(fā)展趨勢三、酵母基因工程的發(fā)展趨勢1、解決酵母基因工程中還存在的缺陷2、在人類基因組計(jì)劃中的應(yīng)用研究是一個(gè)重要的發(fā)展方向3、利用酵母基因工程篩選更多的新藥4、改造釀酒酵母自身降低生產(chǎn)酒精的成本5、酵母的生理承受極限研究6、利用酵母表達(dá)膜蛋白第二節(jié)第二節(jié) 酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)一、酵母表達(dá)系統(tǒng)概述一、酵母表達(dá)系統(tǒng)概述1、酵母表達(dá)載體（

3、1）載體的基本構(gòu)架 （2）載體的復(fù)制形式 附加體型： 2m質(zhì)粒：沒有選擇壓力時(shí)不穩(wěn)定。 自主復(fù)制序列ARS：有選擇壓力時(shí)，整個(gè)群體的平均拷貝數(shù)變得很低，難以用于工業(yè)生產(chǎn)。整合型： 同源序列：拷貝數(shù)低 rDNA單元：拷貝數(shù)高2、宿 主（1）安全無毒，不致病 目前已知的酵母菌極大多數(shù)是安全的，只有白假絲酵母(Candida albicans)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)等極少數(shù)是致病菌或條件致病菌。（2）遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。（3）構(gòu)建的載體DNA容易進(jìn)入，轉(zhuǎn)化頻率較高。（4）發(fā)酵周期短，培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵。（5）蛋白質(zhì)分泌能力良好。（6）

4、有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能。3、酵母的DNA轉(zhuǎn)化（1）原生質(zhì)體法 （2）離子溶液法 （3）一步法 （4）PEG1000法 （5）電穿孔法(electroporation)二、常用酵母表達(dá)系統(tǒng)二、常用酵母表達(dá)系統(tǒng)1、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫 （Saccharomyces Genome Database，SGD） / 免費(fèi) 整合體型 附加體型附加體型整合型釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足：較難進(jìn)行高密度發(fā)酵；蛋白質(zhì)的分泌能力較差；過度的糖基化。2、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：啟動(dòng)子強(qiáng)并受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)對重組蛋白進(jìn)行翻譯后必要的剪接

5、、折疊和修飾，糖基化也更接近高等真核生物甚至人類。甲醇酵母外源蛋白的表達(dá)量比釀酒酵母增加了10100倍。重組菌的遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，表達(dá)量和分泌效率高。能高密度培養(yǎng)，干細(xì)胞量可達(dá)100克/升以上?；蚪M序列：GS115：http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/bogas/DSMZ 70382：整合型表達(dá)載體整合位點(diǎn)：組氨醇脫氫酶編碼基因HIS4區(qū)或AOX1區(qū)啟動(dòng)子：基因AOX1的啟動(dòng)子選擇標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型，常用HIS4信號肽序列：釀酒酵母的分泌信號-交配因子引導(dǎo)序列受體菌：主要有GS115和KM71，均

6、為HIS4突變型。（3）轉(zhuǎn)化方式 原生質(zhì)體法 電激法 氯化鋰法 PEG法。（4）整合方式 1、5AOX1和3AOX1能與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個(gè)拷貝的外源基因；2、染色體AOX1區(qū)與載體質(zhì)粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互換；3、染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換。（5）獲得高拷貝整合轉(zhuǎn)化子的方法 1、G418抗性水平篩選高拷貝2、體外在載體上多次插入目的基因片段3、宿主rDNA或其他非必需高重復(fù)的基因片段同源重組4、利用基因的功能篩選高拷貝整合（7）提高外源基因在甲醇酵母中表達(dá)的注意事項(xiàng) 外源基因中A、T含量，許多高A+T含量的基因常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄；密碼子是

7、否符合甲醇酵母的偏好性；mRNA5非翻譯區(qū)的核苷酸序列和長度會(huì)影響到核糖體40S亞單位對mRNA的識別；選取合適的宿主菌；產(chǎn)物自身的穩(wěn)定性；甲醇酵母液體深層發(fā)酵時(shí)的培養(yǎng)條件是否合適。3、酵母表面展示系統(tǒng) 基于基于a-凝集素的酵母細(xì)胞表面展示凝集素的酵母細(xì)胞表面展示 基于基于-凝集素的酵母細(xì)胞表面展示凝集素的酵母細(xì)胞表面展示釀酒酵母整合型展示表達(dá)載體釀酒酵母整合型展示表達(dá)載體 第三節(jié)第三節(jié) 酵母基因工程的應(yīng)用酵母基因工程的應(yīng)用1利用畢赤酵母生產(chǎn)甘露聚糖酶不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)的蛋白帶2、高產(chǎn)糖化酶重組酵母菌的構(gòu)建 碘液平板篩選不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子菌 物 學(xué) 報(bào), 2011, 30(1): 39-453、代謝工程改造釀酒酵母谷胱甘肽生物合成途徑1. 導(dǎo)入GCS和GS編碼基因2. 敲除-GTP編碼基因3. 超量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子YAP1和MET4思 考 題1.舉例說明酵母基因工程相對大腸桿菌基因工程的優(yōu)勢與不足。2.作為一個(gè)酵母表達(dá)載體，包括哪些基本元件