第三章基因克隆載體

1、第三章第三章 基因克隆載體基因克隆載體p 基因克隆載體基因克隆載體(gene cloning vector): 能承能承載外源基因，將其帶載外源基因，將其帶入受體細(xì)胞得以穩(wěn)定入受體細(xì)胞得以穩(wěn)定維持的維持的DNA 分子。分子?？寺≥d體的功能克隆載體的功能p運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。p為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。p為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。(1) 含有允許外源含有允許外源DNA 片段插入的片段插入的克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)。(2) 能攜帶外源能攜帶外源DNA 片段片段(基因基因)進(jìn)入

2、受體細(xì)胞，在進(jìn)入受體細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制自我復(fù)制； 或能整合到染色體或能整合到染色體DNA、mtDNA 和和cpDNA 中，隨宿主中，隨宿主DNA 同步復(fù)制同步復(fù)制。 (3) 含有供選擇轉(zhuǎn)化子的含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因標(biāo)記基因：(4) 克隆載體必須是克隆載體必須是安全安全的，的， 不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。載體分類(lèi)：載體分類(lèi)：1 1）根據(jù)構(gòu)建克隆載體所用的）根據(jù)構(gòu)建克隆載體所用的DNA 來(lái)源分為：來(lái)源分為：p質(zhì)粒載體質(zhì)粒

3、載體p病毒或噬菌體載體病毒或噬菌體載體p質(zhì)粒質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體與病毒或噬菌體DNA 組成的載體組成的載體p質(zhì)粒質(zhì)粒DNA與染色體與染色體DNA 片段組成的載體等。片段組成的載體等。2）根據(jù)應(yīng)用對(duì)象分：）根據(jù)應(yīng)用對(duì)象分：原核生物克隆載體原核生物克隆載體植物克隆載體植物克隆載體動(dòng)物克隆載體動(dòng)物克隆載體3）按照功能分：）按照功能分：克隆載體克隆載體: 克隆一個(gè)基因或克隆一個(gè)基因或DNA片斷片斷表達(dá)載體表達(dá)載體: 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體整合載體: 把一個(gè)基因插入到染色體組中把一個(gè)基因插入到染色體組中第三章 基因克隆的載體p 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體p 噬菌體克隆載體

4、噬菌體克隆載體p 考斯質(zhì)粒載體考斯質(zhì)粒載體p 單鏈單鏈DNA噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 噬菌粒載體噬菌粒載體p 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 1 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)粒克隆載體p質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)是一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外的裸露是一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外的裸露DNA 分子，一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)分子，一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)DNA分子。分子。p數(shù)量：數(shù)量：每種質(zhì)粒在相應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝每種質(zhì)粒在相應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù)，少者幾個(gè)，多者上百個(gè)。數(shù)，少者幾個(gè)，多者上百個(gè)。p存在廣泛：存在廣泛：許多細(xì)菌、乳酸桿菌、藍(lán)藻、酵母等生物中均許多細(xì)菌、乳酸桿菌、藍(lán)藻、酵母等生物

5、中均發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒。1.1 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1.1.1 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的特點(diǎn)的特點(diǎn)1）分子小：）分子?。?500 kb質(zhì)粒宿主分子大小/kbpPbS藍(lán)藻1.5ColE1E. coli6.4Colv2E. coli140Ti致癌農(nóng)桿菌330左右Pv21三葉草根瘤菌700FE. coli942）編碼基因少）編碼基因少3）環(huán)形）環(huán)形DNA分子分子雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA（酵母的（酵母的“殺傷質(zhì)粒殺傷質(zhì)粒”是是RNA）2 23 3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。如抗菌素個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）

6、。的特性（非必須）。4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型）質(zhì)粒的空間構(gòu)型 共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（ super coil）Covalent close circular DNA 線(xiàn)形線(xiàn)形DNA （ linear ，LDNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 開(kāi)環(huán)開(kāi)環(huán)DNA（ open circular， ocDNA）5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：泳遷移率不同：scDNA最快、最快、L DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒

7、非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移1.1.2 質(zhì)粒的分類(lèi)質(zhì)粒的分類(lèi)1）根據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分為：）根據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分為： 接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒又叫又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。除了帶有自我除了帶有自我復(fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌一套控制細(xì)菌配對(duì)配對(duì)和質(zhì)粒和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移的基因。的基因。如：如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：因子）：能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。不存在該質(zhì)粒的受體菌中。不符合基因工程的安全要求。不符合基

8、因工程的安全要求。雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。胞。如如R質(zhì)粒和部分質(zhì)粒和部分Col質(zhì)粒。質(zhì)粒。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀得同樣的抗生素抗性性狀.R質(zhì)粒Col質(zhì)粒質(zhì)粒帶有控制大腸桿菌素（帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。）合成的基因。大腸桿菌素對(duì)不帶大

9、腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)粒或質(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。為接合型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）拷貝數(shù)少，只有拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。份拷貝。 （接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬?lài)?yán)緊型）。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬?lài)?yán)緊型）。松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多，有拷貝數(shù)多，有1060份拷貝。份拷貝。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。型）。2）根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類(lèi)根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類(lèi)顯性質(zhì)粒（顯性

10、質(zhì)粒（dominant plasmid ）攜帶其他基因，使宿主細(xì)胞呈現(xiàn)新的性攜帶其他基因，使宿主細(xì)胞呈現(xiàn)新的性狀，如抗性質(zhì)粒狀，如抗性質(zhì)粒R等等隱蔽質(zhì)粒（隱蔽質(zhì)粒（concealed plasmid）宿主內(nèi)含有質(zhì)粒，但無(wú)異樣性狀表現(xiàn)。宿主內(nèi)含有質(zhì)粒，但無(wú)異樣性狀表現(xiàn)。但可能有的新性狀并不被人們發(fā)現(xiàn)。但可能有的新性狀并不被人們發(fā)現(xiàn)。3）根據(jù)可否引起宿主出現(xiàn)新性狀分類(lèi)根據(jù)可否引起宿主出現(xiàn)新性狀分類(lèi)任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱(chēng)為質(zhì)粒的時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱(chēng)為質(zhì)粒的不相容不相容性性，不相容性的質(zhì)粒組成，不

11、相容性的質(zhì)粒組成不相容性群不相容性群。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容；擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容； pSC101、F、RP4 擁有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容擁有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容及其衍生質(zhì)粒擁有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容1.1.3質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性1.1.4 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備：實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備：氯化銫密度梯度離心法：氯化銫密度梯度離心法：質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度高、周期純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴化乙錠污染。長(zhǎng)、設(shè)備

12、要求高、溴化乙錠污染。沸水浴法：沸水浴法：質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便。純度底、快速、操作簡(jiǎn)便。堿溶法：堿溶法：質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于之間。純度、操作周期介于之間。2 2）堿變性法：堿變性法： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA與線(xiàn)性染色體與線(xiàn)性染色體DNADNA片斷片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。 在在pHpH值值12.012.012.512.5范圍內(nèi)時(shí)，線(xiàn)性的范圍內(nèi)時(shí)，線(xiàn)性的DNADNA會(huì)被變性會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA卻不會(huì)被變性。卻不會(huì)被變性。 通過(guò)冷卻或恢復(fù)中性通過(guò)冷卻或恢復(fù)

13、中性pHpH值使之復(fù)性，線(xiàn)性染色體形值使之復(fù)性，線(xiàn)性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNAcccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心去除線(xiàn)性染色體，獲得含有去除線(xiàn)性染色體，獲得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNADNA1） 抗菌素抗性抗菌素抗性1.2 質(zhì)粒載體構(gòu)建的基本原理和方法質(zhì)粒載體構(gòu)建的基本原理和方法1.2.1 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：氨芐青霉素抗性（氨芐青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr） 四環(huán)素

14、抗性四環(huán)素抗性 （Tetr） 鏈霉素抗性鏈霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。后，受體菌才能生長(zhǎng)?；罨钏浪揽剐曰蚩剐曰蚩咕乜咕乜咕剡x擇原理抗菌素選擇原理(1) 能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子(2) 具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片段，不影

15、響本身的在此位點(diǎn)中插入外源基因片段，不影響本身的復(fù)制功能；復(fù)制功能； (3) 在基因組中有在基因組中有1-2個(gè)篩選標(biāo)記，為寄主細(xì)胞提個(gè)篩選標(biāo)記，為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型特征。供易于檢測(cè)的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷貝，易于操作。分子量要小，多拷貝，易于操作。 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件天然質(zhì)粒：天然質(zhì)粒：沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。改造的質(zhì)粒。 天然質(zhì)天然質(zhì) 粒粒相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量拷貝數(shù)拷貝數(shù)單一酶切位點(diǎn)單一酶切位點(diǎn)選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記復(fù)制類(lèi)型復(fù)制類(lèi)型pSC1015.81069.09 kb13Eco

16、R Itetr嚴(yán)緊嚴(yán)緊ColE14.210620EcoR I大腸桿菌素大腸桿菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局限性：局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點(diǎn)少、選擇標(biāo)記不合適點(diǎn)少、選擇標(biāo)記不合適 構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則質(zhì)粒載體的基本原則選用合適的出發(fā)質(zhì)粒選用合適的出發(fā)質(zhì)粒獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件組裝合適的選擇標(biāo)記基因組裝合適的選擇標(biāo)記基因選用合適的啟動(dòng)子選用合適的啟動(dòng)子提高外源提高外源DNA的容量的容量需要滅活出發(fā)質(zhì)粒上的某些編碼基因需要滅活出發(fā)質(zhì)粒上的某些編碼基因

17、構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單 質(zhì)粒改造的主要方法質(zhì)粒改造的主要方法減小體積：質(zhì)粒片斷酶切重排、機(jī)械破碎減小體積：質(zhì)粒片斷酶切重排、機(jī)械破碎減少限制性?xún)?nèi)切酶切點(diǎn)減少限制性?xún)?nèi)切酶切點(diǎn)便于檢測(cè)的改造：離體方法、活體方法便于檢測(cè)的改造：離體方法、活體方法復(fù)制特性的改造復(fù)制特性的改造質(zhì)粒安全性的改造質(zhì)粒安全性的改造性狀表達(dá)的改造性狀表達(dá)的改造pSP2124質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ampr基因基因（1） pBR322： 1）元件來(lái)源）元件來(lái)源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。人工構(gòu)建載體。 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來(lái)源于系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)的高拷

18、貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因?；?。 1.3.3 pBR322及其衍生載體的構(gòu)建及其衍生載體的構(gòu)建pBR322pBR322的結(jié)構(gòu)來(lái)源的結(jié)構(gòu)來(lái)源 2）長(zhǎng)度）長(zhǎng)度4363bp 3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)其中其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。個(gè)克隆位點(diǎn)。 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大載體越小越好。載體越小越好。

19、 10kb的的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。在純化過(guò)程中容易斷裂。 5）pBR322的優(yōu)點(diǎn) 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇：插入失活，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞 在在Amp或或Tet中都死亡。中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞獲得載體的寄主細(xì)胞 在在Amp或或Tet其中之一中死亡。其中之一中死亡。pBR322質(zhì)粒載體的篩選質(zhì)粒載體的篩選插入失活篩選法插入失活篩選法氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)10003000copy 安全安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通

20、過(guò)接合轉(zhuǎn)移。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù)高拷貝數(shù) (2) pUC系列University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎(chǔ)上改的基礎(chǔ)上改造而成。造而成。 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)pBR322的的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因基因（1）元件來(lái)源 lacZ的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因大腸桿菌大腸桿菌lacZ的的 -肽鏈序列，肽鏈序列， 是是LacZ 的氨基端片斷。的氨基端片斷。pBR322

21、的的Ampr基因基因（2）長(zhǎng)度）長(zhǎng)度約約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于點(diǎn)，位于lacZ基因的基因的5端。端。pUC 18-19多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)第一，第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù)具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); ; 保留了保留了pBR322pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；控制質(zhì)?？截悢?shù)的點(diǎn)；控制質(zhì)?？截悢?shù)的roprop基因突變，從而使拷貝基因突變，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500700500700個(gè)拷貝。個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體；第二，適用于組織

22、化學(xué)檢測(cè)重組體； 具有來(lái)自大腸桿菌具有來(lái)自大腸桿菌laclac操縱子的操縱子的lacZlacZ基因，所編基因，所編碼的碼的-肽鏈可參與肽鏈可參與-互補(bǔ)作用，用互補(bǔ)作用，用XgalXgal顯色對(duì)重顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而組子進(jìn)行鑒定，而pBR322pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。步的選擇。 第三，具有多克隆位點(diǎn)第三，具有多克隆位點(diǎn)MCSMCS區(qū)段區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)1.3.4 pGEM-3Zp由由pUC派生而來(lái)。派生而來(lái)。p與與pUC的主要區(qū)別是在的主要區(qū)別是在MCS的兩

23、側(cè)分別加了的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和和SP6。p可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。1.3.5 1 1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。Yeast復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記MCS2 2）常用的穿梭質(zhì)粒載體）常用的穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌大

24、腸桿菌釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因。來(lái)回轉(zhuǎn)移基因?？寺?、構(gòu)建克隆、構(gòu)建表達(dá)表達(dá)E.coliAnimal cell利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。3 3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn) 質(zhì)?？寺≥d體的用途質(zhì)?？寺≥d體的用途 p用于保存和擴(kuò)增片段小于用于保存和擴(kuò)增片段小于2kb2kb的目的基因。的目的基因。p構(gòu)

25、建基因組文庫(kù)和構(gòu)建基因組文庫(kù)和cDNAcDNA文庫(kù)。文庫(kù)。p可用于目的基因的測(cè)序?？捎糜谀康幕虻臏y(cè)序。p作為核酸雜交時(shí)探針的來(lái)源。作為核酸雜交時(shí)探針的來(lái)源。回顧回顧plasmid質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體必須必須具備的基本條件具備的基本條件pUC18/19pUC18/19質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pBR322pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pUC18/19質(zhì)粒載體的組成特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)圖。質(zhì)粒載體的組成特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)圖。 插入失活插入失活 -互補(bǔ)互補(bǔ)第三章 基因克隆的載體p 質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體p 噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 考斯質(zhì)粒載體考斯質(zhì)粒載體p 單鏈單鏈DNA噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 噬菌粒載體噬菌粒載

26、體p 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 2 噬菌體載體噬菌體載體噬菌體是一類(lèi)細(xì)菌病噬菌體是一類(lèi)細(xì)菌病毒的總稱(chēng)，英文毒的總稱(chēng)，英文（Bacteriophage），），簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)phage 。蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、（雙鏈、單鏈、線(xiàn)性、環(huán)狀等）。線(xiàn)性、環(huán)狀等）。2 2 噬菌體載體噬菌體載體 2.1 噬菌體的一般特性2.2 噬菌體載體的構(gòu)建2.3 噬菌體載體的類(lèi)型 2.1 噬菌體的一般特性噬菌體的一般特性類(lèi)型：類(lèi)型： 大多數(shù)呈帶尾部的大多數(shù)呈帶尾部的20面型，相當(dāng)一部分為線(xiàn)面型，相當(dāng)一部分為線(xiàn)狀體型。狀體型。核酸：核酸：核酸多數(shù)為核酸多數(shù)為DNA，少量為，少量為RN

27、A，如煙草花，如煙草花葉病毒。葉病毒。噬菌體的生活周期噬菌體的生活周期分為兩種：分為兩種：溶菌周期和溶源周期。溶菌周期和溶源周期。溶菌周期溶菌周期烈性噬菌體烈性噬菌體(virulent phage)感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。釋放出大量子代噬菌體。溶源周期溶源周期p溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage) 感染細(xì)菌后，將自己的感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色整合到細(xì)菌的染色體體DNA中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶

28、源化中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化（lysogenization)。p原噬菌體（原噬菌體（prophage) 整合到細(xì)菌染色體的噬菌體整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱(chēng)為稱(chēng)為原噬菌體原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。2 2 噬菌體載體噬菌體載體 2.1 噬菌體的一般特性2.2 噬菌體載體的構(gòu)建 2.2.1 DNA分子分子 2.2.2 噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建2.3 噬菌體載體的類(lèi)型(1) DNA分子的特點(diǎn)分子的特點(diǎn) （1）長(zhǎng)度為）長(zhǎng)度為48502 bp； （2）雙鏈線(xiàn)性）雙鏈線(xiàn)性DNA； （3）在兩端有）在兩端有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。位點(diǎn)，可以環(huán)化。pcos位點(diǎn)位

29、點(diǎn)（cohensive-end site）：）： DNA兩端各有兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱(chēng)為成的雙鏈區(qū)域稱(chēng)為cos位點(diǎn)。位點(diǎn)。2.2.1 DNA分子分子 ：p DNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型復(fù)制型（RFDNA）。）。cos位點(diǎn)位點(diǎn)（2）基因組基因組DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)v含含50個(gè)以上的基因，各司其職。個(gè)以上的基因，各司其職。A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N COS C

30、OSCOSCOS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因 功能不明區(qū)功能不明區(qū)溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 晚期晚期 溶菌溶菌約有約有20kb生長(zhǎng)非必須區(qū)段生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI cI基因：溶源過(guò)程控制基因?；颍喝茉催^(guò)程控制基因。噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 1）噬菌體是一種噬菌體是一種溫和噬菌體溫和噬菌體，對(duì)大腸桿菌具有很高的感，對(duì)大腸桿菌具有很高的感染能力，以溶源狀態(tài)可保存在大腸桿菌中。染能力，以溶源狀態(tài)可保存在大腸桿菌中。 2）能）能承載比較大外源承載比較大外源DNA：pDNA 上約有上約有20kb 的區(qū)域?qū)Φ膮^(qū)域?qū)κ删w的生長(zhǎng)不是絕對(duì)需噬菌

31、體的生長(zhǎng)不是絕對(duì)需要的，可以缺失或被外源要的，可以缺失或被外源DNA 片段取代。片段取代。 3) DNA上有上有56種限制酶識(shí)別位點(diǎn)（見(jiàn)附錄種限制酶識(shí)別位點(diǎn)（見(jiàn)附錄3-1），），便于便于多種外源多種外源DNA片段的克隆。片段的克隆。2.2.2 噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建 （1）選用）選用噬菌體作為克隆載體的依據(jù)噬菌體作為克隆載體的依據(jù) 基因組太大（基因組太大（49kb）；）； 酶 切 點(diǎn) 太 多 ， 它 有酶 切 點(diǎn) 太 多 ， 它 有 5 個(gè)個(gè) B a m H 1 位 點(diǎn)位 點(diǎn)(GGATCC)，6個(gè)個(gè)Bg位點(diǎn)（位點(diǎn)（AGATCT），），5個(gè)個(gè)EcoR位點(diǎn)（位點(diǎn)（GAATTC）。）。 野

32、生型只能接納一定長(zhǎng)度的野生型只能接納一定長(zhǎng)度的DNA。若相當(dāng)于。若相當(dāng)于噬菌體的噬菌體的75-105%，那么只能接納，那么只能接納49kb5%=2.45kb的的DNA。 噬菌體的缺陷：噬菌體的缺陷： 限制性?xún)?nèi)切核酸酶切去限制性?xún)?nèi)切核酸酶切去DNA的的非必需區(qū)非必需區(qū)p點(diǎn)突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的酶的識(shí)點(diǎn)突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的酶的識(shí)別序列失效，別序列失效，避免外源避免外源DNA 片段插入必需區(qū)片段插入必需區(qū)；pDNA太大，去除非必需區(qū)太大，去除非必需區(qū)DNA (載體分子量載體分子量38kb)（2） 構(gòu)建構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略和技術(shù)路線(xiàn)噬菌體克隆載體的基本策略和技術(shù)路

33、線(xiàn) 在非必需區(qū)插入選擇標(biāo)記基因；在非必需區(qū)插入選擇標(biāo)記基因； 重組重組DNA分子大小必須是原分子大小必須是原 DNA的的75%- 105%； 在除非必需區(qū)人為插入選擇標(biāo)記基因。在除非必需區(qū)人為插入選擇標(biāo)記基因。 建立重組建立重組DNA分子體外包裝系統(tǒng)。分子體外包裝系統(tǒng)。v DNA如質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。如質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。v 在試管中與在試管中與 噬菌體的噬菌體的頭部頭部和和尾部尾部蛋白人工裝配成噬菌體蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中。注入受體菌中。 2 2 噬菌體載體噬菌體載體

34、2.1 噬菌體的一般特性2.2 噬菌體載體的構(gòu)建2.3 噬菌體載體的類(lèi)型 2.3 噬菌體載體的主要類(lèi)型噬菌體載體的主要類(lèi)型 （1）插入式載體：）插入式載體： 一種只具有一個(gè)可供外源一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。 （2）替換型載體（取代型載體）：）替換型載體（取代型載體）： 具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這 兩個(gè)位點(diǎn)之間的兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被區(qū)段可以被外源插入的外源插入的DNA片段所取代。片段所取代。 （1 1）插入型載體：）插入型載體：p只具有一個(gè)外源只具有一個(gè)外源DNA插入限制酶位點(diǎn)，如插入限制酶位點(diǎn)，如 gt10、

35、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、 NM607p可插入長(zhǎng)度為可插入長(zhǎng)度為10kb的外源的外源DNA.p切點(diǎn)位于報(bào)告基因上，故在切開(kāi)切點(diǎn)位于報(bào)告基因上，故在切開(kāi)DNA并插入外源并插入外源基因后，報(bào)告基因失活，即可依此進(jìn)行重組體的基因后，報(bào)告基因失活，即可依此進(jìn)行重組體的篩選篩選插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，載體載體DNA不能進(jìn)入溶不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。 沒(méi)有外源沒(méi)有外源DNA插入的插入的 載體感染受體菌形成載體感染受體菌形成混濁噬菌斑?；鞚崾删?。 如如 NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)

36、（載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因內(nèi)部?；騼?nèi)部。 -半乳糖苷酶失活型載體半乳糖苷酶失活型載體p在在 基因組中引入了基因組中引入了LacZ序列。（其上含有一個(gè)序列。（其上含有一個(gè)EcoR I 克隆位點(diǎn)）?？寺∥稽c(diǎn)）。LacZ EcoR ICharon16A 替換型載體（替換型載體（substitution vectors) 兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于于 DNA的非必須區(qū)兩端。的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用同樣酶切成的外源用同樣酶切成的外源

37、DNADNA片斷置換。片斷置換?？芍脫Q區(qū)可置換區(qū)MCSMCS如：如： EMBL4、Charon40等。等。2) 組裝組裝 1)連接連接3) 侵染侵染替換載體替換載體p主要用于建立主要用于建立cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。p也用于克隆外源目的基因。也用于克隆外源目的基因。2.1.5 噬菌體克隆載體的應(yīng)用噬菌體克隆載體的應(yīng)用第三章 基因克隆的載體p 質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體p 噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 考斯質(zhì)粒載體考斯質(zhì)粒載體p 單鏈單鏈DNA噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 噬菌粒載體噬菌粒載體p 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 3 Cosmid(考考/柯斯柯斯)克隆載體克隆載體 1）柯斯質(zhì)粒載

38、體的組成）柯斯質(zhì)粒載體的組成 2）柯斯質(zhì)粒載體的特性）柯斯質(zhì)粒載體的特性 3）使用柯斯質(zhì)粒載體的基本程序）使用柯斯質(zhì)粒載體的基本程序3.1 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體1978年，年，J. Collins和和B. Hohn等人發(fā)展出等人發(fā)展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid），），是人工構(gòu)建的含有是人工構(gòu)建的含有DNA的的 cos序列（約序列（約20至數(shù)至數(shù)百個(gè)堿基對(duì)）、質(zhì)粒復(fù)制子、抗藥性標(biāo)記及一種或多種限制酶的單一切百個(gè)堿基對(duì)）、質(zhì)粒復(fù)制子、抗藥性標(biāo)記及一種或多種限制酶的單一切點(diǎn)的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體。點(diǎn)的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體。 DNA：cos序列和控制

39、包裝的的序列。序列和控制包裝的的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子質(zhì)粒的復(fù)制子 抗藥性基因抗藥性基因 幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)1）大?。┐笮?46 kb；2）組成）組成3）cosmid vector的特點(diǎn)的特點(diǎn)具有具有 噬菌體的特性噬菌體的特性p在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)）。）。p克隆外源克隆外源DNA后可以后可以體外包裝體外包裝成噬菌體顆粒。成噬菌體顆粒。具有質(zhì)粒載體的特性具有質(zhì)粒載體的特性p大多帶有大多帶有pMB1或或ColE1的復(fù)制子，能像質(zhì)粒一樣

40、的復(fù)制子，能像質(zhì)粒一樣復(fù)制。復(fù)制。方便的選擇方便的選擇有抗生素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。有抗生素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。高容量的克隆能力高容量的克隆能力45kb （最少不能低于（最少不能低于30kb）。）。 使用柯斯質(zhì)粒載體的基本程序使用柯斯質(zhì)粒載體的基本程序 真核生物基因組真核生物基因組DNA Cosmid載體載體 同一種限制性?xún)?nèi)切酶同一種限制性?xún)?nèi)切酶 大小不同的系列大小不同的系列DNA片段片段 Cosmid載體線(xiàn)形載體線(xiàn)形DNA分子分子 體外連接體外連接 兩斷各有一個(gè)兩斷各有一個(gè)Cos位點(diǎn)的重組位點(diǎn)的重組DNA分子分子 噬菌體包裝連接物噬菌體包裝連接物 末端酶識(shí)別、切割重組末

41、端酶識(shí)別、切割重組DNA分子，形成兩端為粘性末端分子，形成兩端為粘性末端 包裝入包裝入噬菌體的頭部噬菌體的頭部 感染大腸桿菌感染大腸桿菌Cos位點(diǎn)環(huán)化，按質(zhì)粒位點(diǎn)環(huán)化，按質(zhì)粒DNA分子的方式復(fù)制、基因表達(dá)分子的方式復(fù)制、基因表達(dá) 第三章 基因克隆的載體p 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)粒克隆載體p 噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 考斯質(zhì)粒載體考斯質(zhì)粒載體p 單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體（M13噬菌體）噬菌體）克隆載體克隆載體p 噬菌粒載體噬菌粒載體p 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 4 單鏈單鏈DNA噬菌體（噬菌體（M13噬菌體）載體噬菌體）載體M13、f1、fd。p單鏈單鏈DNA噬菌體是一類(lèi)絲狀的大腸桿

42、菌噬菌體，噬菌體是一類(lèi)絲狀的大腸桿菌噬菌體，由單鏈環(huán)狀由單鏈環(huán)狀DNA分子外面包裹上一層蛋白質(zhì)外殼分子外面包裹上一層蛋白質(zhì)外殼而成。而成。 M13噬菌體的生物學(xué)特性：噬菌體的生物學(xué)特性：外型絲狀，環(huán)狀單鏈外型絲狀，環(huán)狀單鏈DNA (6407bp)，pM13至少至少11個(gè)編碼基因，個(gè)編碼基因，pM13 DNA不插入到宿主基不插入到宿主基因組中因組中, 不裂解細(xì)菌，但抑不裂解細(xì)菌，但抑制宿主生長(zhǎng)。制宿主生長(zhǎng)。M13 DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體系列載體野生型野

43、生型M13RF-DNAlacZpolylinkerp插入選擇標(biāo)記基因插入選擇標(biāo)記基因p在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝合適的多克隆位點(diǎn)。在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝合適的多克隆位點(diǎn)。M13M13克隆載克隆載體分子結(jié)構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)圖圖 M13 克隆載體的應(yīng)用克隆載體的應(yīng)用v適合用于制備克隆基因的單鏈適合用于制備克隆基因的單鏈DNA。v用于制備測(cè)序用單鏈用于制備測(cè)序用單鏈DNA模板、特異的單鏈模板、特異的單鏈DNA探針，定位誘變等。探針，定位誘變等。DNADNA測(cè)測(cè)序片段序片段的擴(kuò)增的擴(kuò)增+- -+- -+- -+- -+- -+- -單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白R(shí)F型型DNA復(fù)制約復(fù)制約200copy+以以- -鏈鏈

44、DNA為為模板合成模板合成+鏈鏈DNA單鏈單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)為媒介的，這種復(fù)制形式制形式 的的 DNA簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)RFDNA；第三章 基因克隆的載體p 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體p 噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 考斯質(zhì)粒載體考斯質(zhì)粒載體p 單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體（M13噬菌體）噬菌體）克隆載體克隆載體p 噬菌粒載體噬菌粒載體p 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 5 噬菌粒載體噬菌粒載體p M13噬菌體載體突出優(yōu)點(diǎn)，方便制備克隆基因噬菌體載體突出優(yōu)點(diǎn)，方便制備克隆基因的單鏈的單鏈DNA，但插入外源，但插入外源DNA后，遺傳

45、穩(wěn)定性后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降。顯著下降。p 由由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型結(jié)合而成的新型的載體系列。的載體系列。 5.1 噬菌粒載體的特點(diǎn)噬菌粒載體的特點(diǎn)1）組成：噬菌粒）組成：噬菌粒是由單鏈?zhǔn)删w和質(zhì)粒載體是由單鏈?zhǔn)删w和質(zhì)粒載體DNA融合而成。融合而成。p質(zhì)粒質(zhì)粒ColE1的的orip抗生素抗性標(biāo)記抗生素抗性標(biāo)記pM13或或f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)5.2 噬菌粒優(yōu)點(diǎn)：噬菌粒優(yōu)點(diǎn)：載體本身分子小，約為載體本身分子小，約為3000bp，便于分離和操作；，便于分離和操作；克隆外源克隆外源DNA的容量為的容量為10kb，而，而M13噬菌體載體是噬菌體載體

46、是克隆克隆300400bp；兩種復(fù)制方式兩種復(fù)制方式p 噬菌粒在寄主細(xì)胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復(fù)制產(chǎn)生雙噬菌粒在寄主細(xì)胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復(fù)制產(chǎn)生雙鏈鏈DNA。p當(dāng)用輔助噬菌體當(dāng)用輔助噬菌體M13感染宿主細(xì)胞后，噬菌質(zhì)粒的感染宿主細(xì)胞后，噬菌質(zhì)粒的復(fù)制就轉(zhuǎn)變成如同復(fù)制就轉(zhuǎn)變成如同M13噬菌體一樣的滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)噬菌體一樣的滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生單鏈生單鏈DNA。p用途：用途：可用于制備單鏈或雙鏈可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達(dá)外，克隆和表達(dá)外源基因。源基因。第三章 基因克隆的載體p 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體p 噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體p 考斯質(zhì)粒載體考斯質(zhì)粒載體p 單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體（M1

47、3噬菌體）噬菌體）克隆載體克隆載體p 噬菌粒載體噬菌粒載體p 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 p人工染色體載體人工染色體載體（artificial chromosome vector）：）：利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的片段復(fù)制的載體。載體。穿梭載體：穿梭載體：p含有含有第一受體第一受體(大腸桿菌大腸桿菌)內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn) p含有含有第二受體第二受體(如酵母菌如酵母菌)染色體染色體DNA 著絲點(diǎn)、端粒著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及選擇標(biāo)記基因。和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及選擇標(biāo)記基因。6.1 人工染色體克隆載體含

48、義和特點(diǎn)人工染色體克隆載體含義和特點(diǎn)p酵母的自主復(fù)制區(qū)酵母的自主復(fù)制區(qū)ARS序列序列 (autonomously replicating sequence) ，在酵母染色體復(fù)制和質(zhì)粒，在酵母染色體復(fù)制和質(zhì)粒復(fù)制中均復(fù)制中均發(fā)揮復(fù)制起點(diǎn)的功能。發(fā)揮復(fù)制起點(diǎn)的功能。p人工染色體載體人工染色體載體在在第一受體細(xì)胞第一受體細(xì)胞內(nèi)按內(nèi)按質(zhì)粒復(fù)制質(zhì)粒復(fù)制形式形式進(jìn)入高拷貝復(fù)制。進(jìn)入高拷貝復(fù)制。p這種克隆載體在體外與目的這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)片段重組后，轉(zhuǎn)化化第二受體細(xì)胞第二受體細(xì)胞，按，按染色體染色體DNA復(fù)制復(fù)制的形式進(jìn)行的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。復(fù)制和傳遞。p篩選篩選第一受體的克隆子

49、，用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；第一受體的克隆子，用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；p篩選篩選第二受體的克隆子，用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷第二受體的克隆子，用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。型。 p含酵母染色體的含酵母染色體的DNA端粒端粒(TEL)、pDNA 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)(ARS)p著絲粒著絲粒(CEN) p選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記(HIS 和和TRP1)基因基因p多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(MCS)的的DNA 片段片段p大腸桿菌的復(fù)制子大腸桿菌的復(fù)制子p大腸桿菌的選擇標(biāo)記大腸桿菌的選擇標(biāo)記pYAC載體的裝載量為載體的裝載量為350-400 kb6.2 酵母人工染色體克隆載體的構(gòu)建酵母人工染色體克隆載體的構(gòu)建YAC的使用的使用p細(xì)菌

50、人造染色體細(xì)菌人造染色體( BAC)p是在是在F質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb，p人類(lèi)人工染色體載體（人類(lèi)人工染色體載體（HAC）p哺乳動(dòng)物人工染色體載體（哺乳動(dòng)物人工染色體載體（MAC）BAC載體載體p構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)p容納大的外源片段，用于構(gòu)建人類(lèi)和高等生物的基因組文庫(kù)。容納大的外源片段，用于構(gòu)建人類(lèi)和高等生物的基因組文庫(kù)。p基因治療基因治療p大的外源片段能容納完整的基因家族，從而可能校正由多個(gè)突大的外源片段能容納完整的基因家族，從而可能校正由多個(gè)突變位點(diǎn)引起的致病突變。變位點(diǎn)引起的致病突變。p基因功能鑒定基因功能鑒定p大

51、的外源片段包含編碼區(qū)、內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)。大的外源片段包含編碼區(qū)、內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)。6.5 人工染色體克隆載體的應(yīng)用人工染色體克隆載體的應(yīng)用質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體柯斯質(zhì)粒柯斯質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删w克隆克隆DNA大片段大片段*+-構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)-+-構(gòu)建構(gòu)建DNA文庫(kù)文庫(kù)+-常規(guī)的亞克隆化常規(guī)的亞克隆化+-構(gòu)建新型的構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)+-序列分析序列分析+-+單鏈探針單鏈探針+*-+外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+-四種常用載體的比較* * 外源外源DNADNA如超過(guò)如超過(guò)10kb10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * * 已有個(gè)別材料可用于此目的已有個(gè)別材料可用于此目的p列舉質(zhì)粒載體必須具備的基本特性。列舉質(zhì)粒載體必須具備的基本特性。p舉例說(shuō)明什么是穿梭載體？舉例說(shuō)明什么是穿梭載體？p什么是什么是Ti質(zhì)粒和質(zhì)粒和T-DNA？ p為什么野生型的為什么野生型的 噬菌體噬菌體DNA不宜作為基因工程不宜作為基因工程載體？載體？p 噬菌體與噬菌體與cos作載體有何區(qū)別？作載體有何區(qū)別？pM13載